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Title
Mechanisms of starvation-induced p53 stabilization in hepatocytes / presented by Christoph Nössing, BSc
AuthorNössing, Christoph
CensorProkesch, Andreas
PublishedGraz, March 2017
DescriptionVI, 53 Blätter : Illustrationen
Institutional NoteKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2017
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (GND)Transkriptionsfaktor / Leberepithelzelle / Maus
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-137694 Persistent Identifier (URN)
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Mechanisms of starvation-induced p53 stabilization in hepatocytes [2.27 mb]
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Abstract (German)

Der Transkriptionsfaktor p53 spielt ein zentrale Rolle in der Tumorunterdrückung. Aktiviert wird p53 von verschiedensten Stresssignalen, was zur Transkription von p53-Zielgenen führt. Trotz vieler Studien über p53, gibt es nur wenig Wissen über p53s physiologische Funktion. Wir konnten zeigen, dass obwohl die Anzahl der mRNA unverändert blieb, sich die Anzahl von p53 Protein in Lebern gefasteter Mäuse und in Hepatocyten massiv erhöhte. Das Ziel dieser Masterarbeit war deshalb die Aufklärung der p53 Stabilisierung, die durch Fasten ausgelöst wird. Wir vermuteten, dass das erhöhte Vorkommen von p53 durch AMPK verursacht wird. Der AMPK-Komplex beeinflusst die Bindung von p53 an seinen Regulator MDM2. Dadurch wird p53 aktiviert. Um diese Hypothese zu testen wurden Immunpräzipitationsexperiment (IP) durchgeführt. Dazu wurden zuerst p53 und MDM2 in Zelllinien überexprimiert. Nachdem stabile IP-Protokolle etabliert wurden, konnte die Bindung von ektopischen p53 an MDM2 gezeigt werden. Außerdem wurde die endogene Interaktion dieser Proteine in HepG2 Zellen untersucht. Die Isolierung von p53 oder MDM2 alleine wurde mit IP-Experimenten gezeigt, aber es konnte nur eine sehr schwache endogene Interaktion gezeigt werden. Weitere Versuche werden zeigen ob diese Beobachtungen durch technische Probleme verursacht wurden oder ob es tatsächlich eine biologische Relevanz gibt. Außerdem zeigten die letzten Experimente, dass die p53 Stabilisierung wahrscheinlich nicht nur durch AMPK Aktivierung, sondern auch durch eine Destabilisierung von MDM2 selbst verursacht werden.Des Weiteren wurde das CRISPR/Cas9 System verwendet um eine stabile p53 knock-out Zelllinie zu generieren. Diese Zellen dienen als Kontrolle bei Xenotransplantationsexperimenten in Mäusen um die Rolle von Fasten auf die Leberkrebsentstehung zu untersuchen.

Abstract (English)

The transcription factor p53 plays a pivotal role in tumor suppression. p53 can be activated by a variety of stress signals inducing downstream transcriptional programs. Despite the excessive study of p53 there is relative few information about its role in non-cancerous cells. We could show that, while mRNA levels stayed unchanged, p53 protein levels increased under starvation in murine liver and in cultured hepatocytes.The aim of this master thesis was to elucidate the mechanisms behind this p53 protein stabilization under starvation. Based on preliminary experiments, we hypothesized that the increased p53 levels are mediated by AMPK signaling. The AMPK complex controls the binding of p53 to its negative regulator MDM2 and thereby activating p53s transactivation function. To test this hypothesis immunoprecipitation (IP) and co-IP experiments were established. First, p53 and MDM2 were overexpressed in cell lines followed by IP. After optimizing protocol parameters a robust co-pull-down of ectopic p53 and ectopic MDM2 could be shown. These experiments were repeated also in HepG2 cells to investigate the endogenous interaction of p53 and MDM2 under starvation. The pull-down of p53 or MDM2 alone was successful, but endogenous interaction could only be shown partially. It remains to be determined if these observations are caused by technical problems or if it has biological relevance. Furthermore, latest findings suggest that the p53 stabilization might not be only an effect of AMPK activation but also due to destabilization of MDM2 protein level under starvation. Additionally, the CRISPR/Cas9 system was used to derive stable p53 knock-out HepG2 clones, who will be used as isogenic controls in xenotransplantation experiments in mice to investigate the role of starvation and p53 in hepatocellular carcinoma development.

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