Titelaufnahme

Titel
Messung von intrazellulärem Ca2+ in permeabilisierten Endothelzellen / eingereicht von Selina Gottinger
Verfasser/ VerfasserinGottinger, Selina
Begutachter / BegutachterinSchmidt, Kurt
Erschienen2015
Umfang48 Bl. : Zsfassungen (2 Bl.) ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2015
Anmerkung
Zsfassungen in dt. und engl. Sprache
SpracheDeutsch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Calciumstoffwechsel / Endothelzelle / Aorta / Schwein / Calciumstoffwechsel / Endothelzelle / Aorta / Schwein / Online-Ressource
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-88289 Persistent Identifier (URN)
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Messung von intrazellulärem Ca2+ in permeabilisierten Endothelzellen [0.94 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Endoplasmatische Retikulum dient, neben vielen anderen Aufgaben, als intrazelluläre Ca2+-Speicher. Die Freisetzung dieses Ca2+ wird durch Bindung von Inositol-1,4,5-Trisphosphat (IP3) an seinem Rezeptor herbeigeführt. IP3 wird durch agonistische Stimulierung Gq-gekoppelter Rezeptoren oder Rezeptoren mit Tyrosinkinase-Aktivität intrazellulär gebildet. Um in Zuge von intrazellulären Ca2+-Messungen das nicht membrangängige IP3 applizieren zu können muss die Zellmembran permeabilisert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu geeignete Methoden untersucht. Als Modell dienten Endothelzellen der Schweineaorta, die mit dem Ca2+-Indikator Fura 2 beladen wurden. Zur Permeabilisierung wurden Substanzen wie Saponin, Digitonin und Triton X-100 verwendet. Die Versuche wurden am Fluoreszenzmikroskop, der Single-Cell Methode durchgeführt. Triton X-100 erzielte die stärkste Permeabilisation, da es sowohl Plasmamembran, als auch die Membran der Kompartimente permeabilisierte. Bei Permeabilisierung mit Saponin und Digitonin konnte ein biphasischer Effekt beobachtet werden. Die Zellen sind zu Beginn noch in der Lage der Permeabilisierung entgegenzuwirken. Dieser Effekt verliert sich jedoch, bei anhaltender Perfusion mit den Detergenzien. Nach Permeabilisierung verblieb immer eine Restfluoreszenz, die auf noch intakte Ca2+-Speicher zurückzuführen war. Um festzustellen ob die Speicher voll oder leer sind wurde ein Mangan-Quench durchgeführt. Die Methode beruht darauf, dass Mn2+ durch offene Ca2+ Kanäle strömt und die Fluoreszenz von Fura-2 löscht, während diese Phänomen bei geschlossenen Kanälen nicht zu beobachten ist. Da die Versuche ergaben, dass die Kanäle offen und die Speicher leer sind wurden verschiedene Methoden ausprobiert um Speicher wieder zu füllen, allerdings mit keinem Erfolg.

Zusammenfassung (Englisch)

The endoplasmic reticulum serves as intracellular Ca2+ store., from which Ca2+ is released by binding of inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3). The latter is formed intracellularly by agonist stimulation of Gq-receptors or receptors with tyrosinkinase activity. Since IP3 cannot penetrate cell membranes, extracellular application of this transmitter requires membrane permeabilization. The present study was aimed at finding appropriate methods for permeabilization of endothelial cells. Substances, such as saponin, digitonin and Triton X-100 were tested and permabilization was verified by single cell fluorescence microscopy with the Ca2+ indicator Fura-2. Triton X-100 was most effective because it permeabilized not only the plasmamembrane but also the membrane of intracellular compartments. For permeabilization with saponin and digitonin a biphasic effect was detected. Cells are able to counteract permeabilization in an early stage but this effect is lost with continued perfusion with detergents. After permeabilization, a fluorescence signal still remained and was apparently associated with Ca2+ stores. To check, whether these still contain Ca2+ or not, a Mn2+ quench was done. The method is based on the ability of Mn2+ to penetrate open Ca2+ channels and to quench the fluorescence of Fura-2, whereas no effect is seen when Ca2+ stores are filled and channels closed. Since the results revealed that Ca2+ stores are empty after permeabilization, attempts were made to refill the stores. Unfortunately, the procedures tested so far were not successful and additional experiments are required to solve this issue.