Titelaufnahme

Titel
Characterization of L208 variants of human histamine-N-methyltransferase / by Elena Kronegger
Verfasser/ VerfasserinKronegger, Elena
Begutachter / BegutachterinMacheroux, Peter
Erschienen2015
Umfang66 Bl. : Zsfassungen (2 Bl.) ; Ill.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2015
Anmerkung
Zsfassungen in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Histamin / Neurotransmitter / Histamin / Neurotransmitter / Online-Ressource
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-83649 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of L208 variants of human histamine-N-methyltransferase [2.24 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Histamin stellt durch seine Funktionen als Hormon und Neurotransmitter eine Schlüsselkomponente in einigen Organismen dar. Erst kürzlich durchgeführte Studien zeigten, dass das biogene Amine auf zwei Wege verstoffwechselt werden kann: Über oxidative Deaminierung mittels Diamineoxidase (DAO) oder N-Methylierung mittels Histamin-N-Methyltransferase (HNMT). Über welches Enzyme Histamin abgebaut wird, hängt von der Lokalisation im Körper ab. Während DAO für die Inaktivierung von Histamin in der Peripherie verantwortlich ist, übernimmt HNMT den Abbau im zentralen Nervensystem und verhindert dadurch die histaminerge Rezeptordesentisierung. Im Zuge dieser Studie wurden die Auswirkungen von Einzelaminosäurenaustauschen an Position 208 in HNMT untersucht. Bereits zuvor war die Kristallstruktur des Wildtyps gelöst worden. Weiters wurde in Patienten mit intellektueller Beiträchtigung ein einzelner Aminosäureaustausch von Leucine nach Prolin an Position 208 entdeckt. Um den Zusammenhang zwischen der Position 208 und intellektueller Beinträchtigung aufzuklären, wurden gezielt über ortspezfische Mutagenese L208 Varianten hergestellt und in E.coli exprimiert. Von diesen Varianten wurden mit Hilfe von Mikrokalorimetrie durchgeführten Messungen thermodynamische Parameter wie Bindekonstante- sowie auch die katalytische Aktivität ermittelt. Die Messungen zeigten, dass ein Austausch an Position 208 hinsichtlich Bindung von SAM nur eine untergeordnete Rolle spielt, während die katalytische Aktivität der L208F Variante im Vergleich zum Wildtyp ca. 5-fach reduziert ist. Zusätzlich dazu zeigten Experimente bezüglich der Hitzestabilität, dass die Schmelztemperatur der L208F and L208R Variante im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist. Die Bestimmung der Kristallstruktur der Varianten würde helfen die Hypothese zu bestätigen, dass ein veränderter -helikaler Anteil der L208 Varianten im Vergleich zum Wildtyp zu geringer Stabilität führt.

Zusammenfassung (Englisch)

Histamine is a biological key compound in several organisms, where it serves as a neurotransmitter and hormone. Recent studies showed that it can be metabolized in two ways: by oxidative deamination by diamine oxidase (DAO) or N-methylation by histamine-N-methyltransferase (HNMT). Whether metabolization is achieved via DAO or HNMT depends on the localization of histamine. While DAO is required for termination of histamine signalling in the periphery, HNMT is responsible for inactivation of the biological compound in the central nervous system and thereby prevents histaminergic receptor desensitization. In this study, the effect of a single amino acid exchanges at position 208 was investigated. The crystal structure of the wild-type enzyme was already published by Horton et al. Furthermore, in patients with intellectual disability an amino acid exchange, resulting in leucine to proline at position 208 was elucidated. In order to understand the role of residue 208 in intellectual disability, site-directed mutagenesis was conducted to introduce an exchange at residue 208 in HNMT leading to an amino acid exchange from leucine to valine, phenylalanine, arginine, lysine and histidine, respectively. Isothermal titration calorimetry (ITC) was applied to determine the binding isotherm and the catalytic activity of HNMT (L208) variants. ITC experiments revealed that a replacement at residue 208 only plays a minor role in SAM binding, whereas catalytic activity is decreased 5-fold for the L208F variant in comparison to the wild-type. Thermal shift assays revealed that the thermostability of L208F and L208R is decreased in comparison to the wild-type. Protein determination of the crystal structure would help to support the hypothesis that L208 variants display lower structural stability due to a different -helical content as suggested by circular dichroism (CD) measurements.