Titelaufnahme

Titel
Development of an assay system for potential MBD and GM1 chaperones with natural ß-gal substrates / Thomas Kaiser
Verfasser/ VerfasserinKaiser, Thomas
Begutachter / BegutachterinPaschke, Eduard
Erschienen2015
Umfang79 Bl. : Zsfassungen (2 Bl.) ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2015
Anmerkung
Zsfassungen in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Lysosomale Speicherkrankheit / Gangliosidstoffwechsel / Lysosomale Speicherkrankheit / Gangliosidstoffwechsel / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-81213 Persistent Identifier (URN)
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Development of an assay system for potential MBD and GM1 chaperones with natural ß-gal substrates [2.57 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Morbus Morquio B (Morquio B disease; MBD) und GM1-Gangliosidose (GM1) sind zwei klinisch verschiedene lysosomale Speichererkrankungen, die durch Mutationen im Gen GLB1 (ß-Galaktosidase; ß-gal) entstehen. Es ist ungeklärt, warum GM1-Patienten hauptsächlich Defekte im ZNS zeigen, während sich MBD in gestörter Skelett-Entwicklung ohne neurologische Schäden manifestiert. Bei beiden Erkrankungen ist der Abbau natürlicher ß-gal-Substrate, wie GM1 Gangliosid, betroffen. Zuverlässige Tests zur Messung ihres Abbaus in lebenden Zellen sind nicht verfügbar. Ziel der Arbeit war die Messung der Aktivität von GLB1 Mutanten gegenüber GM1 Gangliosid in kultivierten Hautfibroblasten. Normale und mutante Fibroblasten wurden mit bovinem GM1 Gangliosid beladen, die Ganglioside extrahiert, durch Festphasenextraktion isoliert und mittels HPLC-MS analysiert. Das Muster der N-Acyl Ketten in den Gangliosiden GM1, GM2 und GM3 wurde durch HPLC bestimmt und mittels deuteriertem Gangliosid GM1 C18:0 und einer multixplexed SIM-Methode quantifiziert. Erste Resultate zeigen Änderungen der N-Acyl-Isoformen in GM1, GM2 und GM3. Bei kurzzeitiger Beladung (<6h) konnte ein Anstieg von C16:0 und langkettigen Fettsäuren in GM1, GM2 und GM3 beobachtet werden, was auf eine schnelle, vermutlich nicht-lysosomale Umesterung, ohne klaren Anstieg der GM1-Gesamtkonzentration schließen lässt. Bei längerer Inkubation (< 3d) fand sich ein 5-facher, Genotyp-spezifischer Anstieg von GM1 C18:0, der sich in Chase-Experimenten rasch normalisierte. Dies entspricht vermutlich lysosomalen Abbauprozessen von spezieller Relevanz für Pathogenese und Therapie von GM1 und MBD. Ein analytisches Problem besteht durch das Vorkommen mehrerer Sphingosin-Typen (C18 & C20) im kommerziellen, bovinem GM1. Verbesserte Isoform-spezifische interne Standards sind daher erforderlich, um die Entwicklung eines Genotyp-spezifischen, quantitativen Assay zum in-vivo-Abbau von Gangliosiden in GLB1-defizienten Zellen abzuschließen.

Zusammenfassung (Englisch)

Morquio B disease (MBD) and GM1-gangliosidosis (GM1) are clinically diverse lysosomal storage diseases caused by mutations in the GLB1 (ß-galactosidase) gene. It is unknown why patients with GM1 suffer predominantly from CNS affection while MBD results in skeletal changes without neurological involvement. In both diseases lysosomal degradation of natural substrates, like GM1 ganglioside, is involved, but reliable tests on their intracellular handling are not available.We developed an assay to monitor the action of GLB1 mutants on ganglioside GM1 in living cells. Normal and mutant fibroblasts were loaded with bovine GM1 ganglioside for various time periods, gangliosides were extracted, isolated by solid phase extraction and analyzed by HPLC MS. The distribution of N-acyl chains within gangliosides GM1, GM2 and GM3 were determined by HPLC and quantified with deuterated GM1-C:18:0 ganglioside as well as multiplexed SIM. First results could be obtained upon loading of normal and ß-gal deficient with bovine GM1 and observing the changes in N-acyl-isoforms of GM1, GM2 and GM3 gangliosides. Upon short time incubation (<6h), an increase of C16:0 and very long chain fatty acids in GM1, GM2 and GM3 was observed indicating rapid, presumably due to non-lysosomal transesterification of loading material without clear increase of total GM1 concentrations. Upon prolonged incubation (<3d) a 5-fold genotype-specific increase of GM1 C-18:0 over controls was found which normalized rapidly upon chase experiments and thus may rather reflect the degradative, lysosomal events of further interest for experiments on pathogenesis and causal therapy.Due to the existence of two sphingosine backbones (C:18 & C:20) in commercially available bovine GM1 the results have to be interpreted with caution. Improved isoform-specific internal standards have to be introduced until a genotype-specific quantitative assay on ganglioside degradation in GLB1 deficient cells can be defined.

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