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Title
Mechanistic investigations of benzylic sulfate ester hydrolysis using inverting and retaining sulfatases / by Michael Tösch
AuthorTösch, Michael
CensorFaber, Kurt ; Fröhlich, Kai-Uwe
Published2014
Description225 Bl. : 2 Zsfassungen ; Ill., graf. Darst.
Institutional NoteGraz, Univ., Diss., 2014
Annotation
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (GND)Fettalkoholsulfate / Hydrolyse / Fettalkoholsulfate / Hydrolyse / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-76013 Persistent Identifier (URN)
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Mechanistic investigations of benzylic sulfate ester hydrolysis using inverting and retaining sulfatases [7.7 mb]
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Abstract (German)

Die Alkylsulfatase Pisa1 aus dem Pseudomonas Stamm DSM 6611 ist in der Lage ein breites Spektrum an Alkylsulfatestern umzusetzen. Enantioselektivitäten, gemessen in E-Werten, reichten von sehr gering (4) bis hervorragend (>200). Im Zuge der Erweiterung des Substratspektrums war es möglich eine Reihe an Benzylsulfaten zu derazemisieren, inklusive eines Pyridin-Heterozyklus, welcher perfekte E-Werte zeigte. Während der kinetischen Razemtrennung wurde ein Abnehmen des Enantiomerenüberschusses in der Kontrollreaktion beobachtet. Zur Aufklärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde H218O verwendet und der resultierende Einbau des 18O im Produkt verfolgt, wodurch gezeigt wurde dass es sich um eine Kombination aus SN1 und SN2 Mechanismus im Verhältnis 1:1.6 handelt. Der SN1-Reaktion liegt ein planares resonanz-stabilisiertes Carbokation Intermediat zugrunde, welches zur Razemisierung des Produkts führt. Der SN2 Mechanismus führt zur Inversion über einen nukleophilen Angriff am C-Atom. Retention ([OH-]-Angriff am Schwefel) wurde nur zu <3 % beobachtet. Während der Katalyse ist Pisa1 in der Lage, eine chemisch überaus anspruchsvolle Reaktion, die Inversion mit gleichzeitiger Protonierung der schlechten Abgangsgruppe SO42- zu HSO4-, zu ermöglichen. Mit diesem Wissen wurden zinkabhängige Hydrolasen, unter der Berücksichtigung der räumlichen Anordnung wichtiger Aminosäurereste, untersucht und eine "Catalophor-Suche", durchgeführt. Diese förderte drei viel versprechende Kandidaten zutage: Die Alkaline Phosphatase aus Pandalus borealis (AP), eine putative metallabhängige Hydrolase aus Lactobacillus casei, sowie die Ser/Thr Phosphatase 5 aus dem Menschen. Nach eingehendem Substratscreening zeigten weder AP noch die putative Hydrolyse Aktivität. Das Humanenzym bleibt ein viel versprechendes Ziel zur Hydrolyse von Alkylsulfaten.

Abstract (English)

The alkyl sulfatase Pisa1 from Pseudomonas sp. DSM 6611 has been shown to accept a large amount of alkyl sulfate esters. Enantioselectivities, measured as E-values, were ranging from very low (4), to excellent (>200). Expansion of the substrate scope, using benzylic sulfate ester moieties, was achieved, including the resolution of a pyridine heterocyclic compound with perfect E-values. During kinetic resolution, we observed erosion of the enantiomeric excess in the control reaction. Investigation of the underlying autohydrolytic mechanism using H218O to follow the incorporation of the 18O into the product, revealed a combination of SN1 and SN2 mechanisms at a ratio of 1:1.6. The SN1 reaction was shown to occur via the formation of a planar resonance-stabilized benzylic carbocation intermediate leading to racemic product. The SN2 pathway follows the classical nucleophilic attack of an [OH-] onto the benzylic carbon atom, resulting in inversion of configuration. Retention ([OH-] attack on sulfur) was found to be a minor event (<3 %). During catalysis, Pisa1 mediates substrate inversion by protonation of the sulfate ester group R-O-SO3-, thereby providing HSO4- as a good leaving group, making a chemically extremely challenging reaction possible. This knowledge was the basis for a "catalophore-search" to obtain targets with similar arrangement of key residues in the active site. Thus we were able to compare the active site architecture of Pisa1 with the protein database, resulting in three promising candidates: the alkaline phosphatase from northern shrimp (AP), a putative metal dependent hydrolase from Lactobacillus casei and the ser/thr phosphatase 5 from Human. Substrate screening revealed that neither AP, nor the putative hydrolase were active on tested substrates. The human enzyme remains a promising target for the hydrolysis of alkyl sulfates.

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