Titelaufnahme

Titel
Molecular determinants of selectivity and gating in TRPC3 channels / eingereicht von Michaela Lichtenegger
Verfasser/ VerfasserinLichtenegger, Michaela
Begutachter / BegutachterinGroschner, Klaus ; Malli, Roland
Erschienen2014
Umfang84 Bl. : 2 Zsfassungen ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (GND)Ionenkanal / Permeation / Isoleucin / Aufsatzsammlung / Ionenkanal / Permeation / Isoleucin / Aufsatzsammlung / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-68599 Persistent Identifier (URN)
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Molecular determinants of selectivity and gating in TRPC3 channels [12.61 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der nichtselektive Ionenkanal TRPC3 spielt eine wichtige Rolle in vielen (patho)physiologischen Prozessen. Bis heute ist wenig über die Architektur des Proteins sowie über funktionsbestimmende Strukturelemente bekannt.Geleitet durch ein neues Homologiemodell basierend auf der Struktur des Natriumkanals aus Arcobacter butzleri (NavAB), wurden gezielte Mutagenesestudien zur Identifizierung von Aminosäuren mit funktioneller Bedeutung für Ionenpermeation und "gating" durchgeführt.Für Kanäle im offenen Zustand wurde ein Porendurchmesser von <5.8 Å ermittelt und Aminosäuen an Position 629-631 im putativen "pore-loop" als engste Stelle des Permeationsweges identifiziert. Eine negativ geladene Aminosäure innerhalb dieser Region (E630) konnte als funktionelles Schüsselelement des Selektivitätsfilters nachgewiesen werden. Das den Permeationsweg okkludierende "gate" wurde am cytosolischen Ende der porenformenden TM6-Helix lokalisiert. Funktionsbestimmendes Element ist ein Isoleucin, welches die Pore in der inaktiven Konformation verschließt. Eine Mutation innerhalb des "gates" ging mit veränderter Disulfidbrückenbildung im Selektivitätsfilter, reduzierter Ca2+-Selektivität und verstärkter Sensitivität gegenüber dem Porenblocker Rutheniumrot einher. Hiermit wurde im Wesentlichen eine allosterische Kopplung des ?gates? und des Selektivitätsfilters in TRPC3 identifiziert. Basierend auf diesen Erkenntnissen, wurde mit Hilfe einer Ca2+-impermeablen TRPC3-Mutante (E630Q) eine physische Kopplung von TRPC3 mit dem Hypertrophie-assoziierten Calicineurin/NFAT-Signalweg demonstriert. Schließlich konnte die vorliegende Dissertation zur Charakterisierung eines neuen Inhibitors (Pyr10) mit erstmals bedeutender Selektivität für TRPC3 beitragen. Insgesamt gewährte diese Arbeit neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der TRPC3-Funktion sowie deren pathophysiologische Bedeutung, und unternimmt einen ersten Schritt in Richtung Entwicklung klinisch relevanter TRPC3-Modulatoren.

Zusammenfassung (Englisch)

TRPC3 constitutes a non-selective cation channel known to play a critical role in various (patho)physiological processes.To date, structural information on this channel is sparse and molecular structures determining basic channel features are poorly understood.Guided by a novel homology model based on the sodium channel from Arcobacter butzleri (NavAb), we performed site-directed mutagenesis studies to uncover amino acids involved in determining basic channel properties such as ion permeation and gating.Cysteine scanning mutagenesis suggested amino acids at positions 629-631 within the putative pore-loop as the narrowest part of the open permeation path with an estimated pore diameter of <5.8 Å.A negatively charged residue (E630) centrally within this region was identified as the functional key determinant of the selectivity filter.The physical channel gate was localized to the cytosolic end of the pore-forming transmembrane (TM) 6 helix containing a crucial isoleucine residue (I667) that is occluding the permeation path in the resting state.Mutation within the gate was found associated with altered cysteine cross-linking in the selectivity filter, reduced Ca2+-permeability and enhanced channel-block by ruthenium red, suggesting an allosteric coupling between the gate and the selectivity filter in TRPC3.This work was the basis for a novel strategy to study the channel?s function in native tissues.Using a Ca2+-impermeable TRPC3 pore mutant (E630Q), we revealed a physical coupling of TRPC3 channels to the prohypertrophic calcineurin/NFAT-pathway in cardiomyocytes.Finally, this thesis contributed to the identification of a novel TRPC3 blocker (Pyr10) with substantial selectivity for TRPC3.Collectively, the present thesis work provides novel insights into the molecular determinants of TRPC3 channel function as well as its implications in cardiac pathophysiology, and provides a valuable basis for future development of clinically relevant TRPC3 channel modulators.