Titelaufnahme

Titel
Spektroskopische Untersuchung von Fluorochromen in biologischen Geweben / Stefan Michael Sattler
Weitere Titel
Spectroscopy of fluorochromes in biological specimen
Verfasser/ VerfasserinSattler, Stefan Michael
Begutachter / BegutachterinKnoll, Peter
Erschienen2014
UmfangXII, 82 Bl. : Zsfassungen (2 Bl.) ; Ill., graf. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2014
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassungen in dt. und engl. Sprache
SpracheDeutsch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Fluorochrome / Proteine / Spektroskopie / Fluorochrome / Proteine / Spektroskopie / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-67221 Persistent Identifier (URN)
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Spektroskopische Untersuchung von Fluorochromen in biologischen Geweben [8.68 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Untersuchung von Proteinen, welche mit einer Markierung durch Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) versehen wurden, stellt für die Zellbiologie eine wichtige Methode zur Erforschung von zellulären Vorgängen dar. Dabei ist die spektrale Auftrennung der breiten Emissionsspektren der Fluorochrome ein zentrales physikalisches Problem. Ziel dieser Arbeit war es, die spektrale Trennung der verwendeten Fluorochrome zu verbessern und die lokale Verteilung dieser innerhalb einer vitalen Zelle zu bestimmen. In HL-1 Zellen wurden dafür der G-Protein gekoppelte einwärtsgerichtete Kaliumkanal sowie unterschiedliche zelluläre Marker, die mit Varianten des Green Fluoreszent Proteins markiert waren, zur Expression gebracht. Die Messung der Fluoreszenz erfolgte mit einem Konfokalmikroskop. Dabei wurde einerseits ein sequentielles Spektrum über 150 nm in 5 nm Schritten aufgenommen, andererseits Aufnahmen in weiten Detektionsfenstern (ca. 50 nm) erstellt. Zur Auftrennung der Spektren kamen einerseits die Projektion in eine Orthonormalbasis, andererseits die Berechnung aus einer Linearkombination zur Anwendung. Zur Bestimmung der örtlichen Überlappung der Fluorochrome, wurde die Pearson-Korrelation, die modifizierte Korrelation nach Manders, sowie Methoden zur räumlichen Darstellung herangezogen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch "Linear Unmixing" eine verbesserte spektrale Auftrennung der Fluorochrome erreicht werden kann. Dabei zeigt sich, dass die besten Ergebnisse mit einer sequentiellen Anregung im jeweiligen Anregungsmaximums des Fluorochroms und der Detektion über einen weiten Wellenlängenbereich erzielt werden können. Durch die Berechnung der Korrelation nach Pearson und Manders kann eine erste Identifizierung der Colokalisation erfolgen. Zur Beurteilung der räumlichen Verteilung bietet sich die Analyse entlang eines definierten Pfades, sowie die Darstellung eines RGB-Overlaps und einer Verteilungskarte an.

Zusammenfassung (Englisch)

The investigation of fluorochromes labeled proteins is of great interest in cell biology to understand cellular processes. Thereby the spectral separation of the widespread fluorochrome emission spectra is a fundamental physical problem. The aim of this work was to improve the spectral separation of the used fluorochromes and to determine their local distribution inside vital cells.HL-1 cells were used to express G protein activated inwardly rectifying potassium channels and intracellular marker proteins each labeled using variants of the green fluorescent protein. The measurements of the fluorescence were done using a laser-scanning microscope. Two different acquisition techniques were used. On one hand a sequential spectroscopy over a 150 nm range in 5 nm steps was done, on the other hand two distinct broad detection windows were used. The separation was performed by orthogonal projection or by using the linear unmixing algorithm. To measure colocalization Pearson correlation, Manders correlation and spatial colocalization measurements were used.An improved spectral separation using linear unmixing could be examined. Optimal results were reached using a sequential excitation at the peak excitation maximum of each fluorochrome and detection in broad detection windows. By calculating Pearson and Manders correlation a first impression of colocalization was achieved. To identify the spatial distribution of colocalized regions intensity measurements along a certain path and RGB-overlap and colocalization maps showed reliable results.

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