Titelaufnahme

Titel
NMR spectroscopic studies of membrane-bound biological systems / vorgelegt von Walter Hohlweg
Verfasser/ VerfasserinHohlweg, Walter
Begutachter / BegutachterinZangger Klaus ; Gruber Karl
Erschienen2013
UmfangGetr. Zählung : 2 Zsfassungen ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheDeutsch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (GND)Peptide / Proteine / Membrankonstruktion / NMR-Spektroskopie / Peptide / Proteine / Membrankonstruktion / NMR-Spektroskopie / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-47690 Persistent Identifier (URN)
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NMR spectroscopic studies of membrane-bound biological systems [8.71 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

In dieser Arbeit wurde biologische NMR-Spektroskopie verwendet um membrangebundene Peptide und Proteine zu untersuchen, für welche die Gewinnung von Strukturinformationen immer noch große Schwierigkeiten bereitet. Die Arbeit konzentrierte sich vorerst auf mehrere membrangebundene Peptide in Mizellen, welche ein Modellsystem für biologische Membranen darstellen. Hierbei wurde der Protonierungsgrad von Arginin in einer Membranumgebung untersucht. Es fanden sich starke Hinweise auf einen Kation- ?-Komplex im Peptid TM7, welches die siebte Transmembranhelix der Untereinheit a der vakuolären H+-ATPase (V-ATPase) bildet. Die V-ATPase ist eine physiologisch hochbedeutende Protonenpumpe, die in den intrazellulären Membranen aller eukaryotischen Organismen, als auch in der Plasmamembran einiger spezialisierter Zellen vorkommt. Verlust von V-ATPase-Funktion ist mit mehreren Krankheiten im Menschen assoziiert, wie etwa Osteopetrose, distaler renaler tubulärer Acidose oder der Ausbreitung von Krebs. Die V-ATPase wird als potentielles Ziel für die Entwicklung von Medikamenten gegen Osteoporose oder Krebs, als auch in der Entwicklung neuartiger Kontrazeptiva gesehen. Ergebnisse aus der Strukturbestimmung durch NMR-Spektroskopie, NMR-Titrationsexperimenten, paramagnetischer Relaxationsratenerhöhung und Tryptophan-Fluoreszenzspektroskopie bestätigen die Existenz eines in die Membran eingebetteten Kation- ?-Komplexes, der aus dem für den Protonentransport essentiellen Argininrest R735 sowie benachbarten Tryptophan- und Tyrosinresten gebildet wird. In vivo - Experimente an der Hefe Saccharomyces cerevisiae mit selektiven Wachstumsversuchen sowie Fluoreszenzmikroskopie zeigen dass die Bildung eines Kation- ?-Komplexes essentiell für die V-ATPasenfunktion ist. Diese Erkenntnisse werfen ein neues Licht auf den weiterhin rätselhaften Mechanismus des Protonentransports der V-ATPase, und zeigen dass Arginin R735 möglicherweise direkt am Protonentransfer über die Membran beteiligt ist.

Zusammenfassung (Englisch)

In the course of this thesis, biological NMR spectroscopy was employed in studying membrane-bound peptides and proteins, for which structural information is still comparatively hard to obtain. Initial work focused on various model peptides bound to membrane-mimicking micelles, studying the protonation state of arginine in a membrane environment. Strong evidence for a cation-? complex was found in TM7, a peptide which forms the seventh transmembrane helix of subunit a of the vacuolar-type H+-ATPase (V-ATPase). V-ATPase is a physiologically highly relevant proton pump, which is present in intracellular membranes of all eukaryotic organisms, as well as the plasma membrane of several specialized cells. Loss of functional V-ATPase is associated with human diseases such as osteopetrosis, distal renal tubular acidosis or the spreading of cancer. V-ATPase is considered a potential drug target in the treatment of osteoporosis and cancer, or in the development of novel contraceptives. Results from NMR solution structure determination, NMR titration experiments, paramagnetic relaxation enhancement experiments and tryptophan fluorescence spectroscopy confirm the existence of a buried cation-? complex formed between arginine residue R735, which is essential for proton transport, and neighbouring tryptophan and tyrosine residues. In vivo experiments in the yeast Saccharomyces cerevisiae using selective growth tests and fluorescence microscopy showed that formation of the cation-? complex is essential for V-ATPase function. Deletion of both aromatic residues, as well as only the one tryptophan residue leads to growth defects and inability to maintain vacuolar pH homeostasis. These findings shine new light on the still elusive mechanism of proton transport in V-ATPase, and show that arginine R735 may be directly involved in proton transfer across the membrane.

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