Titelaufnahme

Titel
Regulation mechanisms and interactions involved in DNA transfer initiation of R1 plasmid / vorgelegt von Christian Josef Gruber
Verfasser/ VerfasserinGruber, Christian Josef
Begutachter / BegutachterinZechner Ellen ; Keller Walter
Erschienen2013
UmfangVI, 84 Bl. : 2 Zsfassungen ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-47190 Persistent Identifier (URN)
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Regulation mechanisms and interactions involved in DNA transfer initiation of R1 plasmid [9.26 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Konjugativer DNA-Export erfordert drei komplex regulierte Vorgänge: DNA-Prozessierung durch einen Multiprotein-Komplex (Relaxosom), Bindung and den Akzeptor TraD und Export durch den Sekretionskanal. Die Regulierung dieser Prozesse und der Mechanismus der raum- und zeitgerechten Positionierung des Relaxosoms am Sekretionskanal sind unbekannt.Das zentrale Enzym des Relaxosoms ist die Relaxase/Helikase TraI. Es bindet, schneidet und entwindet die DNA und bleibt während des Exports kovalent daran gebunden. Der Aktivierungsmechanismus der TraI Helikase ist unbekannt. Man vermutet, dass es sich dabei um einen späten, essentiellen Regulationschritt handelt, der schlussendlich den DNA Transfer initiiert.In dieser Studie untersuchte ich Interaktionen zwischen TraI, TraD und bekannten Faktoren, die sowohl die Relaxase als auch Helikase Aktivität von TraI in vitro stimulieren. Ich konnte zeigen, dass weder TraDN130 noch der Relaxosomfaktor TraM ausreichen, um die Aktivierung der Helikase in vitro zu ermöglichen. Helikase Aktivierung scheint somit zusätzlich von einem Signal abhängig zu sein das durch Zell-Zell Kontakt hervorgerufen, über den Pilus und den Sekretionskanal via TraD auf TraI weitergeleitet wird und möglicherweise TraM involviert. Raum- und zeitgerechte Orientierung sind für Prozesse, die an einer bestimmten subzellulären Position stattfinden, notwendig. Ich konnte eine Stimulierung der TraI-Relaxase Aktivität durch TypII Plasmidsegregations-Komponenten nachweisen. Mittels biochemischer und biophysikalischer Methoden wurde der Einfluss dieser Proteine auf TraI untersucht. In Kombination mit genetischen Daten schlage ich ein Model vor in dem Segregations-Komponenten eine Positionierung des Relaxosoms ermöglichen und die Formierung eines aktiven DNA-Transfer Komplexes unterstützen.

Zusammenfassung (Englisch)

Conjugative DNA export requires three exquisitely regulated steps: DNA processing by a multiprotein complex (relaxosome), docking to inner membrane substrate acceptor TraD and export through the secretion channel. The regulatory cascade governing these processes is poorly understood. Moreover, spatio-temporal positioning of the relaxosome at the conjugative pore remains obscure.The main relaxosome enzyme is the relaxase/helicase TraI that binds, cleaves and unwinds DNA and stays covalently attached during export to the host. The initiation mechanism of the TraI helicase is unknown but thought to be a late, key-regulatory step that commits the machinery to nucleoprotein export. I aimed to study the protein-protein and protein-DNA interactions between TraI, TraD and factors known to stimulate DNA processing in vitro and their role in helicase activation. I present data that TraDN130 as well as relaxosome factor TraM are insufficient to promote progression from TraI relaxase- to helicase-substrate binding. Thus, implying that helicase activation additionally depends on a signal evoked by cell-cell contact during conjugation that travels through the pilus and the channel and is relayed to TraI via TraD, possibly involving TraM. Spatio-temporal coordination is necessary for processes that happen at a discrete subcellular location. To reach the secretion channel, a mechanism of relaxosome positioning is imaginable. I found that components of a TypeII plasmid segregation system are stimulating TraI relaxase activity. Biochemical and biophysical methods were used to investigate the effects of partitioning proteins on TraI. In combination with genetic data, I propose a model where partitioning proteins adopt a secondary function aiding tethering of the relaxosome to the channel probably supporting the formation of an active DNA-transfer complex.