Titelaufnahme

Titel
Biochemical and structural characterization of the Berberine Bridge Enzyme Variant W165F from Eschscholzia californica / Barbara Steiner
Verfasser/ VerfasserinSteiner, Barbara
Begutachter / BegutachterinMacheroux, Peter
Erschienen2013
UmfangVIII, 69 Bl. : 2 Zsfassungen ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Kalifornischer Mohn / Reticulinoxidase / Biochemie / Kalifornischer Mohn / Reticulinoxidase / Biochemie / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-46864 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Biochemical and structural characterization of the Berberine Bridge Enzyme Variant W165F from Eschscholzia californica [2.52 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In der Natur treten Flavoproteine sehr häufig in den verschiedensten biochemischen Reaktionen auf. Sie enthalten einen zur Katalyse wichtigen nicht-kovalent, mono- oder bikovalent verknüpften FMN oder FAD-Cofaktor. Das ?Berberine bridge enzyme? (BBE) ist ein zentrales Enzym in der Benzylisochinolinalkaloid-Biosynthese und katalysiert die Umsetzung des Substrats (S)-Reticuline in (S)-Scoulerine. BBE weist einen bikovalent verknüpften Cofaktor auf, mit einer Verknüpfung der 8?-Position des Flavin Rings mit His104 und der C6-Position mit Cys166. Trp165 ist ein sehr wichtiger Aminosäurerest in der Substratbindestelle des Enzyms und zeigt eine hohe Flexibilität, was sich eventuell auf die Substratspezifität des Enzyms auswirkt. Im Rahmen dieser Masterarbeit wurde eine detaillierte biochemische und strukturelle Charakterisierung der BBE Mutante W165F von Eschscholzia californica (Kalifornischer Mohn) durchgeführt. Im speziellen wurde der Einfluss von Trp165 auf die katalytischen Eigenschaften, sowie auf den strukturellen Aufbau des aktiven Zentrums des Enzyms genauer betrachtet. Mittels stellenspezifischer Mutagenese wurde Trp165 mit Phenylalanin ausgetauscht und die dadurch erhaltene BBE W165F Mutante biochemisch und strukturell charakterisiert. Die erhaltenen kinetischen Daten sowie ein Abbau des Flavins in ein 4a-Spirohydantoin sind mit dem Wildtyp vergleichbar. Die Kristallstruktur der BBE Mutante W165F zeigt, dass der Aminosäureaustausch zu einer vergrößerten Substratbindetasche führt und so eventuell auch die Umsetzung größerer Substrate möglich ist. Jedoch müssen weitere Studien mit entsprechenden Substratanaloga durchgeführt werden um die Hypothese zu bestätigen. Die Umsetzung neuer und größerer Substrate durch BBE kann mittels Proteinengineering Techniken verbessert werden. Daher wurden drei neue BBE Mutanten hergestellt, bei denen die wichtige Aminosäure Trp165 mit weiteren kleineren Aminosäuren ausgetauscht wurde (W165A, W165V und W165L).

Zusammenfassung (Englisch)

Flavoproteins are prevalent in nature, and they are involved in many biochemical reactions. Flavoproteins contain a non-, mono- or bicovalently attached FMN or FAD cofactor for catalysis. The berberine bridge enzyme (BBE) is a central enzyme in benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis and catalyzes the conversion of (S)-reticuline to (S)-scoulerine. BBE possesses a bicovalently linked FAD with a covalent linkage between the 8?-position of the flavin ring system and His104 and between the 6-position and Cys166. Trp165 was identified as an important residue in the substrate binding site of BBE, which shows a high degree of flexibility and which might be crucial for substrate specificity of the enzyme. Here, I present a detailed biochemical and structural characterization of the BBE variant W165F from Eschscholzia californica (California poppy), where I especially tried to investigate the influence of this amino acid on catalysis as well as on the structural organization of the active site. Trp165 was replaced with phenylalanine using site-directed mutagenesis and the variant protein was structurally and biochemically characterized. The determined kinetic parameters like turnover rate, redox potential, reductive and oxidative rate are comparable to the wild type enzyme. Additionally, a degradation of the flavin to a 4a-spirohydantoin was observed. Again this behavior was already known for the wild type enzyme. From the crystal structure of the BBE W165F variant it is obvious that the amino acid exchange with phenylalanine might provide more space for the conversion of even larger substrates. However, studies with substrate analogs still have to be performed to verify this hypothesis. Moreover, the activity of BBE towards new substrates can be improved by protein engineering techniques, thus new BBE mutants were created, where Trp165 was replaced with small amino acids to hopefully provide even more space for bulky substrates (W165A, W165V and W165L).