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Title
CRISPR/Cas9 mediated knock-out of NCOA1 in PC3 prostate cancer cells / Irene Mahlknecht
AuthorMahlknecht, Irene
PublishedGraz, 2017
DescriptionVI, 71 Blätter : Illustrationen, Diagramme
Institutional NoteKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2017
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Zusammenfassungen in Deutsch und Englisch
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-118610 Persistent Identifier (URN)
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CRISPR/Cas9 mediated knock-out of NCOA1 in PC3 prostate cancer cells [2.8 mb]
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Abstract (German)

NCOA1 (Nuclear Receptor Coactivator 1) ist ein Coaktivator des Androgen Rezeptors, dem wichtigsten Angriffspunkt in der Prostatakrebsbehandlung. Studien zeigten einen engen Zusammenhang zwischen NCOA1 Überexpression und dem Fortschreiten von Prostatakrebs, bzw. der Metastasenbildung. Daher wurde NCOA1 als vielversprechendes alternatives Zielprotein im Kampf gegen Prostatakrebs angesehen, das vor allem in der Behandlung der resistenten Form (CRPC) wichtig sein könnte. CRISPR/Cas9 ist ein Geneditierungssystem, das in molekulartechnischen Verfahren Anwendung findet, z.B. für Gen knock-outs in in vitro oder in vivo-Modellen. Ziel dieser Arbeit war es, ein CRISPR/Cas9 knock-out Experiment zu etablieren, um NCOA1-negative PC3 Zellen zu erzeugen, deren Physiologie untersucht werden sollte. Dazu wurden zwei Zielsequenzen für CRISPR/Cas9 gewählt, die sich im 3. bzw. 6. Exon von NCOA1 befanden und transfizierte PC3 Klone wurden auf DNA- und Proteinebene analysiert. ^Im Zuge der Etablierung wurden bis zu 78 % Transfektionseffizienz erreicht und die Effizienz beim Aussähen von einzelnen PC3 Zellen wurde wesentlich gesteigert, während sich die Zellen durchwegs in gutem Zustand befanden. Die Screening Ergebnisse bewiesen eine hohe Spezifität von CRISPR/Cas9 und die ermittelte Genmodifikation erreichte reproduzierbare Werte von ca. 8 bis 50 %. Zwei Klone mit herabgesetzter und ein Klon ohne NCOA1 Expression wurden gefunden: Der NCOA1-negative Klon und ein Klon mit reduzierter Expression hatten die Zielsequenz im Exon 6, der weitere NCOA1-reduzierte Klon hatte sie im Exon 3. Diese Zellen waren vergrößert und ihre Verdopplungseffizienz war geringer als in Zellen mit normaler NCOA1 Expression. Das Fehlen von NCOA1 beeinträchtigt demnach das Zellwachstum und führt zu Veränderungen der Morphologie. ^Folglich wurde eine NCOA1-knock-out Zellinie erzeugt, womit NCOA1 zukünftig besser charakterisiert werden kann, um eventuell ein neues Ziel für die Prostatakrebstherapie darzustellen.

Abstract (English)

Nuclear Receptor Co-Activator (NCOA) 1 is a coactivator of the Androgen Receptor, the latter being the main target in prostate cancer (PCa) treatment. Based on recent studies a strong link between PCa progression, metastasis formation and NCOA1 overexpression exists. Thus, NCOA1 was suggested to be a promising alternative target to combat PCa, especially when common therapies failed and Castration Resistant PCa (CRPC) arises. CRISPR/Cas9 genome editing is an exciting method enabling the knock-out of genes in in vitro- and in vivo-models. This study aimed to establish the procedures for the CRISPR/Cas9-mediated gene knock-out. The overall aim was to generate NCOA1-negative PC3 cells followed by the physiological characterization of the latter. Two different CRISPR/Cas9 target sites within exon 3 and exon 6 of NCOA1 were tested and transfected single PC3 clones were analyzed on DNA and protein level. During method establishment up to 78 % transfection efficiencies were achieved, efficiency of single cell plating was strongly increased and a consistently good state of the cells was maintained throughout the experiments. Screening of single clones via T7 endonuclease assay showed a specific CRISPR/Cas9-targeting of NCOA1 and reproducible values of % gene modification ranged from approx. 8 % to 50 %. Based on the Western Blot results, two clones with reduced NCOA1 expression and one clone with an absent expression were found. The NCOA1-negative clone and one NCOA1-reduced clone were targeted in exon 6, while the other clone with reduced expression was targeted in exon 3. These cells had an increased size and viability and population doubling efficiency was lower than in cells with normal NCOA1 expression. Thus, the lack of NCOA1 affects cellular growth and lead to morphological changes. In summary, a NCOA1-knock-out PC3 cell line was generated, which helps to better characterize the role of this co-activator and to evaluate it as possible target for PCa therapy.

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