Titelaufnahme

Titel
Analysis of Structural Changes and RNA Release in Human Rhinoviruses
Weitere Titel
Analysis of Structural Changes and RNA Release in Human Rhinoviruses
Verfasser/ VerfasserinWeinzierl, Jakob
ErschienenGraz, 2017
HochschulschriftKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2017
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Abweichender Titel laut Übersetzung des Verfassers/der Verfasserin
DokumenttypMasterarbeit
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-118519 Persistent Identifier (URN)
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Analysis of Structural Changes and RNA Release in Human Rhinoviruses [2.86 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Rhinoviren sind die Hauptursache der gewöhnlichen Erkältung. Die Viren werden durch eine Rezeptor-vermittelter Endozytose internalisiert. Rezeptorbindung und/oder Ansäuerung der frühen Endosomen führen zu einer Konformationsänderung des nativen Virus in ein verändertes, subvirales A-Partikel. Dieses Partikel heftet sich über die Innenseite der Endosomenmembran an und erzeugt eine kleine Pore, durch welche die genomische RNA in das zelluläre Zytoplasma freigesetzt wird. Es ist daher möglich verschiedene Antikörper, die spezifisch gegen diese viralen Konformationen gerichtet sind, zu nutzen. Um den aktuellen Internalisierungsprozess in vitro visualisieren zu können, wurden Antikörper für die Immunofluoreszenz verwendet. Leider wurde bisher kein spezifischer Antikörper gegen das A-Partikel gefunden, der in der Immunofluoreszenz verwendbar wäre. Im ersten Teil dieser Thesis versuchte ich einen solchen Antikörper zu identifizieren. Niclosamid verhindert die Azidifizierung der frühen Endosomen, wodurch kein A-Partikel entsteht. Dieser chemische Eingriff wurde genutzt, um die Spezifität von einer Reihe unterschiedlicher Antikörper zu testen. Um die Geschwindigkeit und Richtung des viralen RNA Austritts durch eine der Poren im A-Partikel untersuchen zu können, wurden intermediäre A-Partikel mit partiell freigesetzter RNA, durch Infektion von HeLa Zellen, in vivo gebildet (Teil 2). Alternativ, wurde der Vorgang in vitro durch Inkubation in Puffern mit niedrigem pH ausgelöst (Teil 3). In beiden Fällen wurde die Freisetzung der RNA zu unterschiedlichen Zeitpunkten gestoppt, jener Teil der RNA, der bereits freigesetzt wurde, verdaut und die A-Partikel mittels Immunopräzipitation isoliert. Das noch im Kapsid vorhandene RNA Fragment wurde mittels RT-PCR und RT-qPCR unter Zuhilfenahme von Primern, die an bestimmte Regionen des viralen Genoms binden, untersucht und mit dem vollständigen Genom des nativen Virus verglichen.

Zusammenfassung (Englisch)

Rhinoviruses are the major causative agents of the upper respiratory tract infections which cause the common cold. Upon infection, virus is internalized by receptor-mediated endocytosis. Receptor binding and/or acidification of the early endosomes trigger conformational modifications of the native virus into the subviral A-particle. This particle attaches to the inner surface of endosomes generating a small pore through which the genomic RNA is released into the cellular cytoplasm. These modifications allow certain antibodies to bind specifically to antigens of the different viral conformations. To visualize the current internalization process in vitro, different antibodies are available, which allow detection of the virus via immunofluorescence. Unfortunately, there is no antibody available yet which binds specifically to the A-particle and allows its detection by fluorescence microscopy. The first part of the thesis focused on finding such an antibody. The agent niclosamide hinders acidification of the early endosome; therefore, no A-particle can be generated. This manipulation of the pathway is used to generate information about the antibodies specificity. To investigate the speed and the direction of the movement of the viral RNA through the pore in the shell of the subviral particle, intermediate forms of the virion with partially released RNA were generated in vivo by infecting HeLa cells (part 2). A-particles can also be generated in vitro by using low pH buffer (part 3). In both cases the uncoating process was stopped at different times, the part of the viral RNA that had been released was digested and these intermediate A-particles were isolated by immunoprecipitation. The unreleased viral RNA strand was analyzed via RT-PCR and RT-qPCR by using a set of different primers binding to different positions on the viral genome. The length of the viral RNA remaining intact can be distinguished and compared with the full-length genome of the native virus.