Bibliographic Metadata

Title
Charakterization of flavin binding properties of the putative protease I from Bacteroides thetaiotaomicron and isolation of flavins from bovine milk / by Julia Koop
AuthorKoop, Julia
CensorMacheroux, Peter
Published2012
DescriptionVII, 51 Bl. : 2 Zsfassungen ; graph. Darst.
Institutional NoteGraz, Univ., Masterarb., 2012
Annotation
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (GND)Bacteroides thetaiotaomicron / Proteasen / Flavine / Bacteroides thetaiotaomicron / Proteasen / Flavine / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-39166 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
Files
Charakterization of flavin binding properties of the putative protease I from Bacteroides thetaiotaomicron and isolation of flavins from bovine milk [2.59 mb]
Links
Reference
Classification
Abstract (German)

Bacteroides thetaiotaomicron ist ein gram-negativer Mikroorganismus, welcher im menschlichen Darmsystem zu finden ist und häufig mit ernsthaften Wundinfektionen, Peritonitis und Sepsis assoziiert wird. Vor kurzem entdeckte man in diesem Mikroorganismus eine putative Hydrolase mit beispiellosen Bindungseigenschaften. Das Auftreten einer Bindungsstelle für Flavinmoleküle neben einem Zinkatom und einer Bindungsstelle für Calcium ist in Hydrolasen recht ungewöhnlich. Demzufolge kann dieses Enzym auch als putative Protease oder molekulares Chaperon klassifiziert werden. Eine Besonderheit stellt vor allem die Flavinbindungsstelle dar aufgrund ihrer unspezifischen Bindung verschiedener Formen des Flavins (Riboflavin, FMN, FAD). Nicht nur natürlich vorkommende, sondern auch chemisch modifizierte Flavine binden mit hoher Affinität zwischen den zwei Tryptophanen, bereitgestellt in der dimeren Bindungstelle. In diesem Zusammenhang wurden Stärke und Präferenz der Bindung von Cofaktoren mittels Differenztitration und Affinitätschromatographie analysiert. Aus der erfolgreichen Bindung der Flavine an die putative Protease I entstand nun die Idee für eine vereinfachte Methode zur Isolation von Cofaktoren aus verschiedenen biologischen Lösungen, wie Milch, Urin und Blut, sowie eine verbesserte Technik zum Nachweis von Flavinen. In dieser Hinsicht wurden diverse Kuh- und Humanmilchproben zur Isolation der Cofaktoren verwendet. Sämtliche Experimente zeigten Riboflavin als dominante Komponente aus den verschiedenen Milchproben. Weiterhin konnte man zwischen freiem und proteingebundenem Riboflavin unterscheiden. Nur ein geringer Anteil an Riboflavin kam frei vor, der Großteil konnte nach Fällung der Milchproteine mit 100%-iger TCA mittels ppBat nachgewiesen werden. Allerdings schwankte die Menge an isoliertem Riboflavin aus den Milchproben, was auf eine beträchtliche Heterogenität in der Zusammensetzung von Milch schließen lässt.

Abstract (English)

Bacteroides thetaiotaomicron is a gram-negative microbe found in the human gut system and is frequently associated with serious wound infections, peritonitis and septicaemia. Recently, a putative hydrolase with unprecedented binding properties was discovered in this microorganism. The occurrence of a binding site for flavin derivatives in addition to a mononuclear zinc and a mononuclear calcium binding site is uncommon for hydrolases. Based on structural relationships this enzyme was classified as a putative protease or molecular chaperone. A special feature of the flavin binding site is its unspecific binding of different forms of flavins (riboflavin, FMN, FAD). Not only naturally occurring, but also chemically modified flavins bind with high affinity between the two tryptophanes provided in the dimer interface. Strength and preference of cofactor binding to the enzyme was analyzed by UV/vis absorbance spectroscopy. The successful binding of flavins to the protein gave rise to a facilitated method of cofactor isolation from various biological sources, such as milk, urea and blood, as well as an improved technique for detection of flavins. Different bovine and human milk samples were used for isolation of riboflavin, FMN and FAD with apo-ppBat. All experiments showed riboflavin as the dominant isolated compound from various milk samples. Furthermore, a distinction between free and protein-bound riboflavin was established. Only a small amount of riboflavin occurred in a free state, the majority was present in a protein-bound form which was recovered by acid precipitation of milk proteins. However, the isolated amounts of riboflavin from the milk samples varied distinctly indicating a high heterogeneity of the composition of milk.