Titelaufnahme

Titel
Effect of growth media on biosynthesis and recycling of tetrahydrobiopterin in porcine aortic endothelial cells / vorgelegt von Christine Sablatschan
Verfasser/ VerfasserinSablatschan, Christine
Begutachter / BegutachterinSchmidt Kurt
Erschienen2012
Umfang50 Bl. : 2 Zsfassungen ; graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Tetrahydrobiopterin / Stickstoffmonoxid-Synthase / Endothelzelle / Tetrahydrobiopterin / Stickstoffmonoxid-Synthase / Endothelzelle / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-38302 Persistent Identifier (URN)
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Effect of growth media on biosynthesis and recycling of tetrahydrobiopterin in porcine aortic endothelial cells [1.13 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Tetrahydrobiopterin (BH4) gehört zur Molekülgruppe der Pteridine und hat eine Vielzahl an zellulären Funktionen. Besonders erwähnenswert ist seine Rolle als essentieller Kofaktor für die Hydroxylasen der aromatischen Aminosäuren und die Stickstoffmonoxidsynthasen (NOSs). In den letzen Jahren wurde in der BH4-Forschung v.a. der Rolle von BH4 für die Entkopplung der NOS viel Beachtung geschenkt. Verminderte BH4-Spiegel können zur NOS-Entkopplung führen, was mit einigen kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert wird. Die BH4-Spiegel werden durch die Aktivität der GTP-Cyclohydrolase (GTPCH) bestimmt. Weiters wird die Bioverfügbarkeit von BH4 durch den Redox-Zustand der Zelle beeinflusst, in dem es mit Oxidantien reagiert und dabei zu Dihydrobiopterin (BH2) umgewandelt wird. BH2 kann durch die Dihydrofolatreduktase (DHFR) wieder zu BH4 reduziert werden.Untersuchungen am Institut zeigten, dass die intrazellulären BH4-Spiegel von Endothelzellen durch Kulturmedien beeinflusst werden. So führt die Kultivierung von Zellen in M199 und MCDB zu verminderten BH4-Spiegel im Vergleich zu in DMEM kultivierten Zellen. Die BH4-Biosynthese und das Recycling in Schweineaortenendothelzellen, die mit verschiedenen Kulturmedien behandelt wurden, wurden durch Messung der GTPCH- und DHFR-Aktivität untersucht. Die DHFR-Aktivität unterschied sich nicht signifikant und kann damit als Grund für verminderte BH4 Spiegel ausgeschlossen werden. Zur Messung der GTPCH-Aktivität musste ein HPLC-Enzymassay etabliert werden. Dazu wurden Veränderungen an einem bereitgestellten Protokoll vorgenommen. So wurde z. B. Askorbinsäure als Reduktionsmittel durch Dithiothreitol (DTT) ersetzt, weil die Inkubation von Askorbinsäure mit Iod-Oxidationsreagenz im Alkalischen bei 37 C einen störenden Peak verursachte. Messungen der GTPCH-Aktivität zeigten eine Tendenz zu erniedrigten Werten für Zellen, die mit M199 und MCDB behandelt wurden. Es müssen jedoch weitere Versuche durchgeführt werden um dies zu bestätigen.

Zusammenfassung (Englisch)

Tetrahydrobiopterin (BH4) belongs to a group of molecules known as pteridines and has numerous cellular functions. Most notably, it is an obligate cofactor for several important enzymes including aromatic amino acid hydroxylases and nitric oxide synthases (NOSs). In recent years, BH4?s role in NOS uncoupling has become one center of attention in this field of research. BH4 deficiency can lead to NOS uncoupling which is associated with cardiovascular pathologies. The levels of BH4 are determined by the activity of GTP cyclohydrolase (GTPCH), the key enzyme in BH4 biosynthesis. BH4 bioavailability is also influenced by the redox state of the cell as BH4 reacts with oxidants, forming cofactor inactive dihydrobiopterin (BH2). BH2 can be reduced to BH4 by dihydrofolate reductase (DHFR).Research at our institute showed that intracellular levels of BH4 in cultured endothelial cells are affected by growth media. Culturing cells in M199 and MCDB leads to diminished BH4 levels compared to cells cultured in DMEM. We investigated biosynthesis and recycling of BH4 in porcine aortic endothelial cells treated with different media by monitoring the enzyme activity of GTPCH and DHFR. DHFR activity did not differ significantly in cells treated with DMEM, M199 and MCDB and thus can be ruled out as reason for decreased BH4 levels. Before GTPCH activity could be measured, a HPLC enzyme assay had to be established. Several adjustments were made to a provided working protocol. Those changes included substituting the ascorbic acid used as a reducing agent by dithiothreitol (DTT). Incubating ascorbic acid with iodine oxidizing reagent in an alkaline range at 37 C caused a disturbing peak in the chromatogram which was prevented by using DTT. When GTPCH activity was measured, a trend towards reduced GTPCH activity in PAEC treated with M199 and MCDB could be shown, but further investigation is needed to confirm this tendency.