Titelaufnahme

Titel
Development of activity based protein profiling and imaging methods using a "clickable" esterase/lipase probe / Martin Viertler
Verfasser/ VerfasserinViertler, Martin
Begutachter / BegutachterinBirner-Grünberger, Ruth
Erschienen2012
UmfangVI, 82 S. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Enzymaktivität / Proteinmuster / Enzymaktivität / Proteinmuster / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-36582 Persistent Identifier (URN)
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Development of activity based protein profiling and imaging methods using a "clickable" esterase/lipase probe [7.33 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Fragestellungen zur Dynamik enzymatischer Aktivität, können oftmals nur durch Aktivitätsbestimmungen korrekt beantwortet werden. Wird jedoch eine komplexe biologische Probe einer Aktivitätsmessung unterzogen, können in klassisch biochemischen Methoden die einzelnen Enzymaktivitäten nicht aufgelöst werden. Daher macht es sich die aktivitätsbasierte Proteinprofilerstellung (ABPP) zur Aufgabe, jede einzelne Komponente einer oder mehrerer Enzymklassen innnerhalb einer komplexen Probe funktionell zu charakterisieren. Dies wird durch niedermolekulare Sonden erreicht, welche ausschließlich Enzyme in einem aktiven Zustand detektieren.Neuerlich entwickelte ABPP Methoden erreichen funktionelle Charakterisierung von Serinhydrolasen in lebenden Zellen und intaktem Gewebe, unter Anwendung von Kupfer katalysierter Alkin Azid [2+3] Huisgen Zykloaddition zur Reporterkopplung [Speers et al., 2003],[Schicher et al., 2009]. Die hier beschriebene Studie versucht die Leistung der CuAAC-ABPP Methode zur Analyse von Esterasen und Lipasen nach Schicher et al. zu verbessern und aktivitätsbasierte bildgebende Verfahren zu entwickeln. Im Zuge dieser Arbeiten, konnte die Machbarkeit von aktivitätsbasierter Bildgebung an mehreren überexprimierten Lipasen gezeigt werden. Angewandt auf Zellmodelle für Adipozyten, konnte die hier gezeigte Methode jedoch keineVisualierung von Esterasen/Lipasen in ihrer aktiven Form erreichen. Ergebnisse aus Gelelektrophorese Experimenten weisen darauf hin, dass die Effizienz bzw. die Nebenreaktionen der CuAAC und Staudinger Ligation nicht ausreichend sensitiv sind um Sonden-Enzym Komplexe von geringer Häufigkeit darzustellen. Daher leisten die heir gewonnenen Erkenntnisse einen wichtigen Beitrag zur Weiterentwicklung von ABPP und aktivitätsbasiertenBildgebungsverfahren basierend auf ?klick?-baren Sonden für Esterasen bzw. Lipasen.

Zusammenfassung (Englisch)

Questions on the dynamics of enzyme function can, in most cases, only be answered byactivity measurements. However, if activities of a complex biological sample are assayedusing classical biochemical approaches, single enzymatic components can not be resolved.Hence, activity based protein profiling seeks to functionally characterise all individual componentsof a targeted enzyme class within a complex sample. This is achieved by smallmolecule probes, which exclusively detect enzymes in their active state.Recently developed ABPP methods achieve functional characterisation of serine hydrolasesin living cells and intact tissue, using copper mediated alkyne azide [2+3] Huisgencycloaddition for reporter coupling [Speers et al., 2003] [Schicher et al., 2009].The current study sets out to improve the performance of the CuAAC-ABPP methodreported by Schicher et al. and to develop an activity based imaging approach.In the course of the work described herein,the feasibility of an activity based imagingapproach was shown for several over expressed lipases. However, when applied to adipocytemodel cells, the method did not achieve visualisation of endogenous esterases/lipases. Resultsobtained from gel based experiments imply that the kinetics and side reactions ofCuAAC and Staudinger ligation do not offer sufficient sensitivity for the detection of lowabundant probe-enzyme complexes. Hence, the data presented herein lay the ground forfurther developments of ABPP and activity based imaging approaches using ?clickable? esterase/lipase probes.