Titelaufnahme

Titel
2D-Gelelektrophorese des Aspergillus nidulans Proteoms mit freien Trägerampholyten und Klonierung von EXT-1 / Martin Schönwetter
Verfasser/ VerfasserinSchönwetter, Martin
Begutachter / BegutachterinKungl Andreas
Erschienen2012
Umfang137 S. : 2 Zsfassungen ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheDeutsch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Aspergillus nidulans / Zweidimensionale Elektrophorese / Aspergillus nidulans / Zweidimensionale Elektrophorese / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-35619 Persistent Identifier (URN)
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2D-Gelelektrophorese des Aspergillus nidulans Proteoms mit freien Trägerampholyten und Klonierung von EXT-1 [6.16 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Aspergillus nidulans ist ein gut etabliertes Modellsystem für das Verständnis der Nitratverwertung. Ziel dieser Diplomarbeit war es, die Methoden der Proteomforschung, insbesondere die 2D?Gelelektrophorese, zur Trennung der Proteine aus Zellen von A. nidulans zu optimieren. Es sollten reproduzierbare 2D-Gele sowohl von nicht induzierten als auch von Nitrat induzierten Zellen hergestellt werden, um zu sehen, welche Proteine bei der Nitratverwertung beteiligt sind. Diese Proteine sollten in den 2D-Gelen als signifikant abweichende Spots erkennbar sein. Da im Zeitraum der praktischen Arbeit keine induzierten Zellen zur Verfügung standen, beschränkten sich die Arbeiten auf nicht induzierte Zellen. Die Arbeiten umfaßten die Optimierung des Zellaufschlusses und der anschließenden Aufreinigung des Protein-Pellets sowie die Optimierung der Isoelektrischen Fokussierung und der Proteinfärbung mit Silber. Mit der erarbeiteten Methode konnten durchaus akzeptable 2D-Gele generiert werden. Eine gute Reproduzierbarkeit war jedoch aufgrund der Verwendung von freien Trägerampholyten nur bedingt gegegeben. Besser reproduzierbare Ergebnisse dürften sich durch die Anwendung der IEF mit immobilisierten pH-Gradienten ergeben.Als zweite Teilaufgabe sollte das Gen EXT1 kloniert werden. EXT1 kodiert für das Protein Exostosin-1, welches gemeinsam mit einem zweiten Protein, Exostosin-2, an der Copolymerisation von Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin zu Heparansulfat beteiligt ist. Mutationen am EXT1 Gen führen zu Krankheiten wie z.B. der hereditären multiplen Exostosen (HME). Mittels PCR wurde das gewünschte DNA-Fragment aus dem mEXT1 template amplifiziert und anschließend mit Hilfe eines TOPO®-Vektors in kompetente, bakterielle Wirtszellen transformiert. Nach der Vermehrung dieser Bakterien in LB-Amp Selektionsmedium wurde eine Plasmidpräparation zur Extraktion der vermehrten DNA durchgeführt. Trotz aufwendiger Fehlersuche lieferte dieses Verfahren nicht das gewünschte Ergebnis.

Zusammenfassung (Englisch)

Aspergillus nidulans is an important research organism for studying nitrate assimilation. The main goal of this diploma thesis was to optimize the methods of proteomics, especially the 2-D gel electrophoresis, for separating the proteins of A. nidulans cells. Reproducible 2-D gels of non induced and nitrate induced cells were to be produced in order to see which proteins are involved in the nitrate assimilation. These proteins would be identified as significantly different spots in the 2-D gels. Since there were no induced cells available during this diploma thesis all research was conducted with non induced cells. The research comprised the optimization of cell disruption and the subsequent purification of the protein pellets as well as the optimization of the isoelectric focusing and the silver staining of the proteins in the 2-D gels. The established method resulted in quite acceptable 2-D gels. A good reproducibility however was given only partially due to the fact that the IEF was conducted with carrier ampholytes. Better results could probably be achieved with immobilized pH gradients.A second goal of this diploma thesis was to clone the EXT1 gene. EXT1 encodes the protein exostosin 1, which is - together with a second protein, exostosin 2 ? involved in the copolymerization of glucuronic acid and N-acetylglucosamine to heparan sulfate. Mutations of EXT1 can lead to illnesses such as hereditary multiple exostoses (HME). Via PCR the DNA fragment of interest was amplified from the mEXT1 template and then a transformation into competent bacteria host cells was performed with the help of a TOPO® vector. After growth of these bacteria in LB-AMP selective growth medium the cloned DNA was extracted by plasmid preparation. Despite the effort of intensive troubleshooting the procedure didn't show the desired result.

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