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Titel
Aufreinigung und enzymatische Charakterisierung von [alpha/beta] Hydrolase Domain 6 (ABHD6) / Vera Leber
Verfasser/ VerfasserinLeber, Vera
Begutachter / BegutachterinZimmermann Robert
Erschienen2011
UmfangIII, 76 Bl. : 2 Zsfassungen ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. und engl. Sprache
SpracheDeutsch
DokumenttypMasterarbeit
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-34493 Persistent Identifier (URN)
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Aufreinigung und enzymatische Charakterisierung von [alpha/beta] Hydrolase Domain 6 (ABHD6) [3.25 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die ?/? Hydrolase Domain 6 (ABHD6) ist eine Serin-Hydrolase, welche die Fähigkeit hat, Monoacylglycerol zu hydrolysieren. Man nimmt an, dass ABHD6 eine wichtige Rolle im Abbau von 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) besitzt, das im Körper als Signallipid wirken kann und zu den Endocannabinoiden gehört. Die Wirkung von Endocannabinoiden wird durch die psychoaktive Hauptsubstanz von Marijuana, ?-9-Tetrahydrocannabinol, imitiert. Anders als klassische Neurotransmitter, können Endocannabinoide aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften nicht in synaptischen Vesikel gespeichert werden. Vielmehr werden sie auf einen bestimmten Reiz hin synthetisiert, in den synaptischen Spalt ausgeschüttet und durch enzymatischen Abbau wieder inaktiviert. Kürzlich wurde gezeigt, dass ABHD6 die 2-AG mediierte Signalübertragung beeinflussen kann. Welche physiologische Funktion die ABHD6 tatsächlich besitzt, und ob ABHD6 eine spezifische Monoacylglycerol-Hydrolase ist, oder auch andere Lipide spalten kann, ist ungeklärt.Das Ziel meiner Masterarbeit war es, ABHD6 aufzureinigen, um eine enzymatische Charakterisierung zu ermöglichen. Auf der Suche nach einem geeigneten Expressionssystem konnte gezeigt werden, dass ABHD6 nicht aktiv ist, wenn sie in E.coli exprimiert wird. Dies könnte darauf hinweisen, dass spezielle posttranslationale Modifikationen für die Aktivität des Enzyms benötigt werden. Dagegen war es möglich, aktive ABHD6 aus S.cerevisiae aufzureinigen. Um die Substratspezifität des Enzyms zu untersuchen, wurden verschiedene Lipidsubstrate getestet. Es konnte gezeigt werden, dass ABHD6, zusätzlich zu Monoacylglycerol, auch Retinylester spalten kann, jedoch kein Cholesterinester und Triacylglycerol. Kinetische Messungen ergaben, dass die Affinität zu Retinylester mindestens 10-fach höher ist, als zu Monoacylglycerol. Dieses Enzym könnte daher sowohl den Abbau von Endocannabinoiden, als auch den Stoffwechsel von Retinoiden beeinflussen.

Zusammenfassung (Englisch)

Purification and enzymatic characterization of ?/? hydrolase domain 6 (ABHD6).The ?/? hydrolase domain 6 (ABHD6) is a serine-hydrolase capable of hydrolysing the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) and other monoacylglycerols. 2-AG is the most abundant endogenous activator of cannabinoid receptors in the body. The effect of 2-AG and other endocannabinoids is mimicked by ?-9-tetrahydrocannabinol, the major psychoactive component of marijuana. Due to the hydrophobic properties of endocannabinoids, they cannot be stored in synaptic vesicles and set free into the synaptic cleft in response to a specific stimulus, like classic neurotransmitters. In fact they are synthesized from phospholipid precursors on demand and inactivated by enzymatic degradation. Recently, it was shown that ABHD6 controls the accumulation of 2-AG at cannabinoid receptors suggesting that this enzyme controls 2-AG mediated signalling events. However, the physiological function of ABHD6 is poorly understood and it is not known whether the enzyme acts as specific monoacylglycerol hydrolase or if it also degrades other lipids.The aim of my master thesis was to purify recombinant and active ABHD6 for enzymatic characterization. Our studies demonstrate that recombinant ABHD6 expressed in E.coli is inactive. Yet, expression in S.cerevisiae revealed an active enzyme implicating that ABHD6 requires posttranslational modifications for enzyme activity. In addition to monoacylglycerols, ABHD6 was also capable of degrading retinylester, but did not hydrolyse cholesterylester and triacylglycerol. Kinetic measurements showed that the affinity to retinylester is about 10-times higher in comparison to monoacylglycerol. However, the turnover rate of monoacylglycerols is about 30-times higher than that of retinylester. In conclusion, our observations suggest that ABHD6 is not a specific monoacylglycerol hydrolase and might influence also other lipid pathways than the endocannabinoid system.

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