Titelaufnahme

Titel
Nucleic acid transit through the R1-16 type 4 secretion system / Paul Kirchberger
Verfasser/ VerfasserinKirchberger, Paul
Begutachter / BegutachterinZechner Ellen
Erschienen2011
Umfang75 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Gentransfer / Bakterielle Konjugation / Kernproteine / Gentransfer / Bakterielle Konjugation / Kernproteine / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-33113 Persistent Identifier (URN)
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Nucleic acid transit through the R1-16 type 4 secretion system [5.3 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der reverse Nukleoproteintransit infektiöser R17 Phagen durch das Typ 4 Sekretionssystem von Plasmid R1-16 wurde benützt, um eine Reihe von Schritten in der Aktivierung des Translokationskanals und dem darauffolgenden Substrattransfer zu definieren. Ein funktionelles Relaxosom inklusive oriT- und nic- sites, Proteinen TraI, TraM, TraY und ATP-hydrolysierendes TraD ist für Nukleoprotein Import (Phageninfektion) und Export (Konjugation) notwendig. Interessanterweise konnte die Phagensensitivität in traI Knockout-Stämmen nicht nur durch Hinzufügen von TraI, sondern auch durch TraI-Fragment TraIN992 wiederhergestellt werden. Dieses Fragment, bestehend aus den TraI Relaxase- und TSA-Domänen, ist dasselbe, welches ? zusammen mit dem Helikase-Fragment TraI?N308 ? für effiziente Konjugation benötigt wird. Weitere Experimente zeigten, dass die DNA-Schneidefunktion der Relaxase und die Relaxase-assoziierte ssDNA Bindeaktivität für Phageninfektion wichtig sind. Andererseits beeinflusste Störung Helikase-assoziierter ssDNA Bindeaktivität die Phageninfektion nicht, was weiter darauf hinweist, dass Helikaseaktivität nur für Nukleoprotein Export benötigt wird. Zusätzlich reduzieren mehrere TraI Varianten mit 31aa Insertion in TSA die Phagensensitivität, was die Bedeutung von TSA-mediiertem Docking in Konjugation und Phageninfektion aufzeigt. Diese Ergebnisse erlauben eine Definierung von zwei Schritten in der Aktivierung des T4SS Kanals. Aktivierungsschritt 1, ausreichend für Phageninfektion aber nicht Konjugation, benötigt DNA Bindung und Schnitt durch die TraI Relaxase-Domäne und Interaktion von TraI Translokationssignalen mit TraD. Ein regulatorisches Relay und gegenseitige Modulierung zwischen TSA und TraD erlauben die Weiterleitung von Signalen vom Relaxosom zum T4SS und umgekehrt. Dies führt zu Aktivierungsschritt 2, bestehend aus einem Wechsel von Relaxase- zu Helikase-Aktivität, was zur Entwindung der DNA und dem Transport des Substrates durch den Kanal führt.

Zusammenfassung (Englisch)

A reverse nucleoprotein transit of infectious bacteriophage R17 particles through the type 4 secretion system of conjugative plasmid R1-16 was utilized to define a series of steps in the activation of the translocation channel and consequent substrate transfer. A functional relaxosome including oriT and nic sites, proteins TraI, TraM, TraY as well as ATP-hydrolyzing TraD was found to be necessary for both nucleoprotein import (phage infection) and export (conjugation). Interestingly, phage sensitivity in traI knockout strains could be restored not only by the addition of TraI, but also with the TraI fragment TraIN992 in trans. This fragment, consisting of the TraI relaxase and TSA domains, is the same fragment that is required -together with the helicase fragment TraI?N308 - for efficient conjugation. Further experiments showed that relaxase cleavage and relaxase associated ssDNA binding activities are important for phage infection. On the other hand, a disruption of the helicase associated ssDNA binding activity did not influence phage sensitivity, further indicating that helicase activity is only needed in nucleoprotein export but not import. Additionally, several TraI variants with 31aa insertions within TSA reduce phage sensitivity, highlighting the importance of TSA mediated docking not only in conjugation but also in phage infection. These results allow the definition of two distinct steps in the activation of the T4SS channel. Activation step 1, sufficient for phage infection but not conjugation, requires DNA binding and cleavage of the TraI relaxase domain as well as interaction of the TraI translocation signals with TraD. A regulatory relay and mutual modulation between TSA and TraD allows signals to be conveyed from the relaxosome to the T4SS and vice versa. This leads to activation step 2 which consists of a switch from relaxase to helicase activity, resulting in the unwinding of DNA and transport of the substrate through the channel.