Titelaufnahme

Titel
Structural and functional analysis of human UDP-glucuronic acid decarboxylase / Sabine Sykora
Verfasser/ VerfasserinSykora, Sabine
Begutachter / BegutachterinNidetzky, Bernd
Erschienen2011
Umfang93 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2011
Anmerkung
Zsfassung in engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Proteoglykane / Uridindiphosphat <Uridin-5'-diphosophat> / Glucuronsäure / Decarboxylasen / Proteoglykane / Uridindiphosphat <Uridin-5'-diphosophat> / Glucuronsäure / Decarboxylasen / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-30874 Persistent Identifier (URN)
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Structural and functional analysis of human UDP-glucuronic acid decarboxylase [6.65 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

In der Proteoglucansynthese spielt UDP-Glucuronsäure Decarboxylase (EC 4.1.1.35, UXS) eine essentielle Rolle, weil dieses Enzym die NAD-abhängige Bildung von UDP-Xylose (UDP-Xyl) aus UDP-Glucuronsäure (UDP-GlcA) katalysiert. Obwohl UXS in verschiedenen Spezies stark konserviert ist, waren Analysen mit Röntgenkristallographie und kinetische Daten zur Ermittelung des Reaktionsmechanismus auf ArnA (EC: 1.1.1.305), eine bakterielle UDP-GlcA Decarboxylase, die UDP-4-keto-pentose und NADH erzeugt, begrenzt. In dieser Studie wurden die selben Analysetechniken wie bei ArnA mit humanen UXS1a und mit dessen Punktmutationen durchgeführt und mit NMR-Spektroskopie kombiniert, um die katalytische Rolle bestimmter Aminosäurereste zu ermitteln. Die Röntgenkristallstruktur von UXS1a (2B69) wurde mit NAD+ und UDP gesichert. Ein Modell von UDP-GlcA wurde ins Reaktionszentrum dargestellt. Wild-typ UXS1a und vier rekombinante Mutanten von dieser (Y147F, R277Q, E120A and E120Q) wurden exprimiert und mit sichtbarer Homogenität gereinigt. Die vollständige Analyse vom wild-typ Enzym ergab das UXS1a ist funktionell als Dimer mit einer Wechselzahl von 0.16 s-1, dessen Michaelis Konstanten 5 mM für UDP-GlcA und 4 ?M für NAD+ sind. Y147F und R277Q haben eine Restaktivität, die 1000-fach geringer ist als die vom Wild-typ und erzeugten UDP-4-keto-pentose als Hauptprodukt. Die katalytische Effizienzen waren vermindert: 800-fach für UDP-GlcA und 80.000-fach für NAD+. Die Wechselzahlen von E120Q und E120A, waren 150 bzw. 120 mal geringer, wobei Dissoziationskonstanten für UDP-GlcA und NAD+ vergleichbar mit jenen vom Wild-typ waren. Das Endergebnis aus der Strukturanalyse und der kinetischen Untersuchungen ist ein Reaktionsmechanismus für UXS1a, in dem Y147 als die katalytische Base ist, die ein Proton von und zu der 4 ?-Hydroxylgruppe von GlcA überträgt, und R277 zusammen mit E120 an der Decarboxylation und der Stabilisierung der Bindung vom Intermediat beteiligt ist

Zusammenfassung (Englisch)

An essential role in proteoglucansynthesis is played by UDP-glucuronic acid decarboxylase (EC 4.1.1.35, UXS), which catalyzes the NAD+ depending interconversion of UDP-glucuronate (UDP-GlcA) to UDP-xylose (UDP-Xyl). Although UXS is strongly conserved in different species, X-ray crystallography and kinetic analysis to elucidate reaction mechanism have been limited only to ArnA (EC: 1.1.1.305), a bacterial UDP-GlcA decarboxylase that yields NAD+ to UDP-4-keto-pentose and NADH. In this study the same analysis techniques as used for ArnA combined with NMR spectroscopy were carried out with human UXS1a and its site-directed mutations, in order to elucidate the catalytic role of particular amino acid residues in the UXS1a-catalyzed conversion of UDP-GlcA to UDP-Xyl. The crystal structure of UXS1a (2B69) was solved with NAD+ and UDP. The structure of GlcA was modelled inside the active site. Wild-type UXS1a and four recombinant mutants of it (Y147F, R277Q, E120A and E120Q) were expressed and purified to apparent homogeneity. The thorough analysis of wild-type enzyme determined that human UXS1a is functional as dimer with a turnover number of 0.16 s-1 and Michaelis constants of 5 mM for UDP-GlcA and of 4 ?M for NAD+. The Y147F and R277Q mutants had a residual activity 1000 times lower than that of wild-type enzyme and yielded UDP-4-keto-pentose as main product. The catalytic efficiencies of these mutants were reduced: 800 times for UDP-GlcA and 80 000 times for NAD+. The turnover numbers of E120Q and E120A were respectively 150 and 120 times lower, whereas dissociation constants for NAD+ and UDP-GlcA were comparable to that of wild-type UXS1a. The conclusion of structural and kinetic analysis with key active site mutants is a reaction mechanism for human UXS1a, where Y147 is the catalytic base transferring a proton from and to the 4 ?-hydroxyl group of GlcA and R277 together with E120 is involved in the decarboxylation and the stabilization of the binding of intermediate.