Titelaufnahme

Titel
Aufreinigung und Charakterisierung einer primären Alkoholdehydrogenase aus Janibacter terrea / vorgelegt von Bernhard Peter Mairinger
Verfasser/ VerfasserinMairinger, Bernhard Peter
Begutachter / BegutachterinKroutil Wolfgang
Erschienen2011
Umfang114 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2011
SpracheDeutsch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Alkoholdehydrogenasen / Alkohole <primär-> / Strahlenpilze / Alkoholdehydrogenasen / Alkohole <primär-> / Strahlenpilze / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-28681 Persistent Identifier (URN)
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Aufreinigung und Charakterisierung einer primären Alkoholdehydrogenase aus Janibacter terrea [5.05 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Ziel dieser Diplomarbeit war es, eine Alkoholdehydrogenase ADH zu finden, die als Substrat primäre Alkohole annimmt. Als Standardsubstrat diente Benzylalkohol, der zu Benzaldehyd oxidiert wird, gleichzeitig wird das Cosubstrat Acetaldehyd zu Ethanol reduziert und dadurch das Nicotinamidadenindinucleotid NAD+ rezykliert. Auf der Suche nach geeigneten Mikroorganismen kristallisierte sich Janibacter terrae DSM 13953 als ein viel versprechender Kandidat heraus. Zur Aufreinigung wurde PIPES als Puffer verwendet, die Zellwand von J. terrae wurde mit Lysozym vorbehandelt, damit beim nachfolgenden Ultraschallaufschluss mehr Protein aus den Zellen freigesetzt werden konnte und danach erfolgte eine Temperatur- und Ammoniumsulfatpräzipitation. Nach der erfolgten Vorreinigung konnte mit der eigentlichen Reinigung und dem Aufkonzentrieren des Proteins begonnen werden. Dazu diente die Hydrophobe Interaktionschromatographie HIC, Ionenaustauschchromatographie IEC, Affinitätschromatographie mit BlueSepharose 6Fast Flow und Größenausschlusschromatographie SEC. Die Reinigung wurde mit SDS-Gel überprüft und nachdem nur mehr eine Bande zu sehen war, wurde von dieser die Aminosäuresequenz bestimmt und eine Homologiesuche im Genom von J. terrae und in bekannten Proteinen durchgeführen. Leider ergaben sich keine Treffer, was auf ein fehlerhaft bestimmtes Genom schließen lässt, da die Suche unter bekannten Proteinen diverse ADHs lieferte. Von den beiden besten Treffern, einer NDMA-Oxidoreduktase aus Amycolatopsis methanolica und einer eisenhältigen ADH aus Nakamurella multipartita DSM 44233, wurden Vektoren angefertigt die einen Strep-Tag enthielten und auf möglichen Umsatz getestet. Leider ergab sich bei den beiden Proteinen keinerlei Aktivität, nicht für das Standardsubstrat Benzylalkohol und die natürlichen Substrate der beiden ADHs, Methanol bzw. Ethanol, was eventuell auf ein denaturiertes Protein (durch den Strep-Tag) hinweist.

Zusammenfassung (Englisch)

The aim of this diploma thesis was to find an alcohol dehydrogenase ADH, which accepts primary alcohols as substrates. As a standard substrate benzyl alcohol was used, which is oxidised to form benzaldehyde. At the same time the cosubstrate acetaldehyde is reduced to form ethanol, whereby the nicotinamiddinucleotide NAD+is recycled. After a long search for suitable microorganisms, Janibacter terrae DSM 13953, was identified as a promising candidate. For purification PIPES was used as a buffer, for pre-cleaning, the cell wall of J. terrae had to be pretreated with lysozyme, so that more protein from the cells could be released during subsequent ultrasonic lysis. This was followed by a temperature and ammonium sulfate precipitation to remove cell debris and other protein from the supernatant. After the completion of the pre-cleaning the actual purification and concentration of the protein could be started. For this task, hydrophobic interaction chromatography HIC, ion exchange chromatography IEX, affinity chromatography with BlueSepharose 6Fast flow and size exclusion chromatography SEC were used. Purification was checked by SDS electrophoresis. When only one band was left, it was excised and sequenced to perform a homology search in the genome of J. terrae and other known proteins. Unfortunately no hits were found which leads to the conclusion that the given genome was inappropriate, because the search with blast provided many ADHs. Of the two best matches, an NDMA oxidoreductase from Amycolatopsis methanolica and an iron-containing ADH from Nakamurella multipartita DSM 44233, vectors containing a Strep-Tag were prepared and the enzymes were tested for activity. Unfortunately no activity was detected for the two proteins, neither for the standard substrate benzyl alcohol nor for the natural substrates of the two ADHs, methanol and ethanol, which probably points to a denatured protein (caused by the Strep-tag or another factor).