Bibliographic Metadata

Title
Development and analysis of recombinant saccharomyces cerevisiae strains displaying enhanced coenzyme availability / Monika Hoislbauer
AuthorHoislbauer, Monika
CensorKlimacek, Mario
Published2011
DescriptionIII, 81 Bl. : Zsfassung ; graph. Darst.
Institutional NoteGraz, Univ., Masterarb., 2011
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (GND)Saccharomyces cerevisiae / Biotransformation / Alkohol / Chirale Verbindungen / Saccharomyces cerevisiae / Biotransformation / Alkohol / Chirale Verbindungen / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-26242 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
Files
Development and analysis of recombinant saccharomyces cerevisiae strains displaying enhanced coenzyme availability [1.49 mb]
Links
Reference
Classification
Abstract (German)

Chirale Alkohole sind wichtige Bausteine in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. Dabei ist der Einsatz von Saccharomyces cerevisiae als Ganz-Zell-Biotransformationssystem eine vielversprechende Alternative zur chemischen Synthese und zu isolierten Enzymen. Durch eine enzymatisch katalysierte NAD(P)H abhängige Reduktion eines Ketosubstrates, wird der gewünschte chirale Alkohol gebildet. Aus ökonomischen Gründen muss NAD(P)H regeneriert werden. Das wird von der Zelle durch Assimilation eines Cosubstrates erreicht. Häufig sind Cosubstratverbrauch und Ketoreduktion bezüglich des Coenzymverbrauchs nicht ausbalanciert. Dies führt zu niedrigen Produktausbeuten pro Cosubstrat, da das meiste produzierte NAD(P)H zur Herstellung von Nebenprodukten verwendet wird. Daher wurden mit dem Ziel der Erhöhung von verfügbarem NAD(P)H für die gewünschte Ketoreduktion rekombinante S. cerevisiae Stämme konstruiert. Die von 2,3-Butanediol-Dehydrogenase katalysierte Reduktion von Acetoin zu Butanediol wurde als Modellreaktion ausgewählt, um den Einfluss von Stoffwechselwegmanipulationen auf die zelluläre NAD(P)H Verfügbarkeit zu untersuchen. Die Deletion der Alkohol Dehydrogenase 1 und die Überexpression von BDH1 erbrachten eine 5-8-fache Erhöhung der Butanediol-Bildungsrate als Folge einer erhöhten NADH Verfügbarkeit. Der beste Stamm erreichte eine Butanediol-Bildungsrate von 3,3 mol/gZTG/h und eine Butanediol-Ausbeute von 1,3 mol pro mol Glukose. Um die NADPH Verfügbarkeit zu erhöhen, wurde die lösliche Transhydrogenase von Escherichia coli in S. cerevisiae mit mBDH oder mit BDH1 und mBDH überexprimiert. Leider zeigte SthA nur geringe Aktivität. Deshalb konnte dessen mögliches Potential zur Verbesserung der NADPH-abhängigen Ketoreduktion nicht untersucht werden. Enzymkinetische Analysen und physiologische Überlegungen weisen auf eine kombinierte NADPH (71%) und NADH (29%) Verwendung von mBDH hin, wobei bezüglich der katalytischen Effizienz NADPH stark bevorzugt wird (30-fach).

Abstract (English)

Chiral alcohols are important building blocks in chemical and pharmaceutical industrie. Application of Saccharomyces cerevisiae as a whole cell biotransformation system is a promising alternative to chemical syntheses or use of isolated enzymes. The desired chiral alcohol is formed by an NAD(P)H-dependent reduction of the corresponding ketosubstrate catalyzed by enzymes termed ketoreductases. For economic reasons NAD(P)H has to be regenerated. This is achieved by the cell by the assimilation of a cosubstrate. Often cosubstrate utilization and ketoreduction are not well balanced with respect to coenzyme utilization and lead to low product yields per cosubstrate converted while most of NAD(P)H produced is used to form undesired byproducts. Recombinant S. cerevisiae strains were constructed with the intention to enhance NADH or NADPH availability for a desired ketoreduction reaction. The reduction of acetoin to butanediol catalyzed by 2,3-butanediol dehydrogenase was selected as model reaction to investigate effects from metabolic pathway engineering on cellular NADH and NADPH availability. Disruption of the alcohol dehydrogenase 1 gene and overexpression of BDH1 resulted, as a consequence of increased NADH availability, in a 5-8-fold enhancement of the butanediole production rate. The best strain developed was able to convert acetoin to butanediole with a rate of 3.3 mol/gCDW/h and at a butanediole yield of 1.3 mole per mole glucose utilized. To enhance availability of NADPH the soluble transhydrogenase SthA from Escherichia coli was overexpressed in S. cerevisiae containing mBDH alone or together with BDH1. Unfortunately, SthA displayed only marginal activity precluding detailed analysis of its potential to improve NADPH-dependent ketoreduction. Enzyme kinetic analysis combined with physiological considerations suggested that mBDH utilized both NADPH (71%) and NADH (29%) while in terms of catalytic efficiencies NADPH is strongly preferred over NADH (2.5-fold).

Stats
The PDF-Document has been downloaded 63 times.