Titelaufnahme

Titel
Characterization of adipose triglyceride lipase / Catherina M. Ebner
Verfasser/ VerfasserinEbner, Catharina
Begutachter / BegutachterinOberer Monika
Erschienen2011
Umfang79 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Lipasen / Fettsucht / Lipasen / Fettsucht / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-26033 Persistent Identifier (URN)
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Characterization of adipose triglyceride lipase [1.78 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Unter Säugetieren wird Energie hauptsächlich in Form von Triacylglycerol (TAG) gespeichert welche im Fettgewebe als Lipid-tropfen (Lipid droplets) vorliegen. Bei Energiebedarf werden diese unter Freisetzung von nicht esterifizierten freien Fettsäuren (NEFA) hydrolysiert um Energiegewinn via ?-oxidation zu gewährleisten. Lipolyse, der Abbau von TAG, stellt einen hochregulierten Prozess dar, welcher von drei Enzymen katalysiert wird. Adipöse Triglycerid Lipase (ATGL) katalysiert den ersten, geschwindigkeitsbestimmenden Schritt welcher zur Freisetzung der ersten NEFA führt. Hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoacylglycerol Lipase (MGL) hydrolysieren die Esterbindung der zweiten sowie dritten Fettsäure zum Glycerol Grundgerüst. Das minimale Konstrukt von ATGL welches seine enzymatische Aktivität behält ist 254 Aminosäuren lang und wurde determiniert von Irina Cornaciu, einem Mitglied unserer Gruppe (Manuskript in Präparation). Das Ziel dieser Arbeit beinhaltete die Entwicklung eines Protokolls zur Reinigung des minimalen Konstrukts von ATGL um damit kristallographische bzw. biophysikalische Experimente durchführen zu können. Maus ATGL 254 (mATGL254) wurde in verschiedene Vektoren kloniert und die Expression in E.coli optimiert. In den Reinigungsexperimenten wurde versucht Hürden wie das Auftreten von ?Inclusion bodies? und löslichen Proteinaggregaten zu meisten. Vielversprechende Ergebnisse lieferte mATGL254 gekoppelt an Maltose-binde-Protein, wobei sehr hohe Ausbeuten erzielt wurden. Die Bildung von löslichen Aggregaten konnte jedoch trotz intensiver Bemühungen nicht verhindert werden. Smt-mATGL254 stellt ein Konstrukt dar welches zwar in geringen Mengen aber dafür in monomerer Form gewonnen werden konnte. Der Vektor wurde dahingehend verändert eine TEV-Protease Schnittstelle sowie einen (His)8- tag an Stelle eines (His)6- tags zu tragen da sich herausgestellt hatte das eine Reinigung des Fusionsproteins nur unter denaturierenden Bedingungen zu hohen Ausbeuten führt.

Zusammenfassung (Englisch)

In mammals the main energy storage is represented by triacylglcerol (TAG) accumulated in lipid droplets (LD) in adipose tissue. In times of energy demand TAGs are hydrolyzed with subsequent release of non-esterified fatty acids (NEFAs) to produce energy via ?-oxidation. Lipolysis, the breakdown of TAG is a highly regulated process catalyzed by three enzymes. Adipose triglyceride lipase (ATGL) is in charge of the first and rate limiting step, as it catalyzes the release of the first NEFA from the glycerol backbone. Hormone-sensitive lipase (HSL) and the highly specific Monoacylglycerol lipase (MGL) hydrolyze the ester bonds between the second and the third fatty acid of the glycerol backbone, respectively.The minimal construct of ATGL still active in hydrolyzing TAG and localizing to the LD is 254 amino acids long and has been determined by our group (Irina Cornaciu et al, manuscript in preparation).The aim of this work was to establish a purification protocol for the minimal active fragment of mouse ATGL (mATGL254) with the objective of performing crystallization trials and biophysical experiments.Mouse ATGL 254 was cloned into several vectors and expression optimized. Purification trials were performed, where hurdles such as the occurrence of inclusion bodies and soluble aggregates have been tried to overcome. Promising results gave mATGL254 fused to Maltose-binding protein, where high yield was obtained. Although much effort has been made to prevent aggregation, the problem still needs to be solved. Smt-mATGL254 a construct that could be obtained in monomeric form but low yield was engineered to carry a TEV-protease cleavage site. Purification trials showed that exposure of the (His)6-tag is promoted under denaturing conditions only. On account of that a (His)8-tag was engineered via site-directed mutagenesis, for better binding in affinity chromatography.