Titelaufnahme

Der selektive Transfer von Makromolekülen durch bakterielle Typ IV Sekretionssysteme(T4SS) besteht aus drei Schritten: Substratverarbeitung, -rekrutierung und ?translokation. Währendwir einiges über die Substratverarbeitung in konjugativen Systemen wissen, sind uns die Details wiedie DNA- oder Proteinsubstrate erkannt und rekrutiert werden noch weitestgehend unbekannt. Inaktuellen Modellen übernimmt die Rolle des Substratrezeptors, welcher das Zytosol mit dem T4Kanal verbindet, das T4 coupling protein (T4CP). Diese Studie setzte sich zum Ziel die molekularenDeterminanten der Erkennung von konjugativen Relaxasen zu definieren und diese Erkennung mitdem Substratverarbeitungs- und ?translokationsprozess zu verbinden.Diese Studie zeigte zum ersten Mal, dass die Relaxase-Helicase, TraI, von Plasmid R1 in funktionellerForm in den Rezipienten transportiert wird. Mittels eines Cre recombinase assay for translocation(CRAfT) wurden zwei unabhängige Translokationssignale (TS) auf dem TraI Protein identifiziert.Tertiäre Strukturvorhersagen für die TS stimmten am besten mit RecD2 von Deinococcus radiodurans(PDB code 3e1s) überein. Mutagenese spezifischer Aminosäuren enthüllte eine Schlüsselposition fürspezifische Substraterkennung. Ein klareres Bild über die Evolution von Relaxasen konnte mittelsbioinformatischen Analysen gezeigt werden. Ich stellte die Hypothese auf, dass Interaktionenzwischen TraI TS und dem T4CP die DNA-Verarbeitung beeinflussen und konnte beweisen, dass einephysische Kopplung von einem TS an die katalytische Relaxasedomäne notwendig ist für effizientenDNA-Transfer. Desweiteren konnten zytosolische Komponenten für die T4 Kanalaktivierungidentifiziert werden. Zusammen zeigen diese Daten ein klareres und detaillierteres Bild derregulatorischen Prozesse an der Verbindungsstelle zwischen dem Relaxosom und dem T4CP.

The selective transfer of macromolecules by bacterial type IV secretion systems (T4SS)involves three general activities: substrate processing, recruitment, and translocation. In conjugationsystems our understanding of the substrate processing reaction is advanced, yet the details of howDNA or protein substrates are recognized and recruited to the T4 channel remain obscure. In currentmodels the role of the substrate receptor controlling the connection between the cytosol and the T4channel is performed by the T4 coupling protein (T4CP). This study aimed to define moleculardeterminants for recognition of a conjugative relaxase and to connect this process with substrateprocessing and translocation.This study provided evidence that the relaxase-helicase, TraI, from plasmid R1 is translocated to therecipient cell in a functional form. A Cre recombinase assay for translocation (CRAfT) mapped twotranslocation signals (TS) on the TraI proteins of related F-like plasmids that independently mediateT4 translocation of the protein. Tertiary structure predictions for the TS matched best RecD2 fromDeinococcus radiodurans (PDB code 3e1s). Rational mutagenesis revealed a key residue crucial to thefidelity of substrate selection. Bioinformatic analyses showed that the recognition module isconserved among diverse families of conjugative T4SS bringing a clearer picture of the evolution ofrelaxases. I hypothesized that interactions between the TraI TS and the T4CP would modulate TraIcatalyzedconjugative DNA processing reactions and provide evidence that a physical connectionbetween the TS and the relaxase catalytic domain is crucial for productive conjugative DNA transfer.Moreover, the cytosolic components required for T4 channel activation were identified. Together thedata provide a clearer picture on the regulation events at the relaxosome/T4CP interface.