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Title
Transfektion von Makrophagen mit siRNA und Plasmiden : Expression und "Silencing" von Targetproteinen oxidierter Phospholipide / Franziska Vogl
AuthorVogl, Franziska
CensorHermetter, Albin
Published2011
Description82 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
Institutional NoteGraz, Univ., Masterarb., 2011
LanguageGerman
Document typeMaster Thesis
Keywords (GND)RNS-Interferenz / Transfektion / Makrophage / RNS-Interferenz / Transfektion / Makrophage / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-24133 Persistent Identifier (URN)
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Transfektion von Makrophagen mit siRNA und Plasmiden [4.06 mb]
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Abstract (German)

Oxidierte Phospholipide (oxPL) werden aus mehrfach ungesättigten Phospolipiden unter oxidativem Stress in Membranen und Lipoproteinen gebildet. Sie induzieren in vaskulären Zellen Apoptose. In einer vorangehenden funktionellen Proteomstudie wurden potentielle Targets eines Aldehydophospholipids, die wichtig für die apoptotische Signal-transduktion sind, identifiziert. Folgestudien haben nun das Ziel herauszufinden, welche Proteinkandidaten die Ceramid-vermittelte Apoptose auslösen.Zu diesem Zweck werden zwei verschiedene Strategien verfolgt. Die erste Strategie verwendet siRNA-Technologie um die Expression der Targetproteine zu unterdrücken und in der Folge die Auswirkungen auf Ceramidbildung und Apoptose zu überprüfen. Der zweite Ansatz beruht auf der Expression fluoreszierender Fusionsproteine, die das Targetprotein enthalten, um mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) die direkten Wechselwirkungen mit den fluoreszierenden Lipidanaloga zu messen.In der vorliegenden Arbeit wurden fünf Fusionsproteine von RFP und den identifizierten Proteinkandidaten kloniert und in Cos-7 Zellen exprimiert. Die Tranfektionen von RAW 264.7 Makrophagen mit siRNA, die mit chemischer Transfektion und mittels Elektroporation durchgeführt wurden, lieferten in beiden Fällen gute Ergebnisse. Der Gen-?Knock-Down? mittels siRNAs wurde für GAPDH und Caspase-3 optimiert. Die Transfektionen und das ?Silencing? wurden mit FACS-Messungen, Western Blots und qPCR überprüft. Ein Enzym-?Knock-Down? führte zu einer erniedrigten Proteinexpression und zum Verlust der Enzymfunktion. In der Folge wurden die Zellen gegenüber der oxPL-vermittelten Apoptose resistenter.

Abstract (English)

Oxidized phospholipids (oxPL) are generated from (poly)unsaturated glycerophospholipids in membranes and lipoproteins under conditions of oxidative stress. They induce apoptosis in the cells of the vascular wall.In a previous functional proteomics study the primary protein targets of an aldehydophospholipid were identified in macrophages. To find out which of these protein candidates are involved in lipid-mediated cell death we are following two different strategies. The first one uses siRNA technology to knock down the target proteins and measure the effect on cell death and signalling. The second approach is based on fusion proteins containing the protein candidates and RFP to measure Förster-resonance-energy-transfer (FRET) and determine the spacial proximity to fluorescently labelled oxPL.In this work protocols for chemical transfection of RAW 264.7 cells with expression plasmids were optimized. Five fluorescent fusion proteins were cloned and expressed in Cos-7 cells using the most efficient technique. Chemical transfection and electroporation were used to transfect cells with siRNA against GAPDH and Caspase-3. Transfections and silencing were tested using FACS-measurements, Western blotting and qPCR and proved to be efficient in both cases. Silencing of caspase-3 was associated with a decrease in protein expression and loss of function. As a consequence, enzyme knock-down rendered the cells more resistant towards oxPL-induced apoptosis.