Titelaufnahme

Titel
Heterologous expression of SQSTM1/p62 for NMR-spectroscopy and redox-characterization / Ina Hollerer
Verfasser/ VerfasserinHollerer, Ina
Begutachter / BegutachterinAbuja Peter
Erschienen2010
Umfang95 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Skleroproteine / Stoffwechselweg / Genexpression / Escherichia coli / Skleroproteine / Stoffwechselweg / Genexpression / Escherichia coli / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-22516 Persistent Identifier (URN)
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Heterologous expression of SQSTM1/p62 for NMR-spectroscopy and redox-characterization [7.4 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das humane Protein SQSTM1/p62 ist ein Gerüstprotein, das mit verschiedenen strukturellen Motiven unterschiedliche Substrate binden kann und somit eine wichtige Rolle in mehreren Stoffwechselwegen des menschlichen Körpers spielt. Vor allem polyubiquitinierte, geschädigte Signalproteine werden intrazellulär von SQSTM1/p62 gebunden, wodurch pro-apoptotische und Überlebenssignalwege aktiviert werden. Darüber hinaus ist SQSTM1/p62 in der TNF-?-abhängigen Signalkaskade in die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-?B durch Verknüpfung von RIP und PKC? bzw. IKK-? involviert. SQSTM1/p62 stellt aufgrund dessen einen Knotenpunkt in zellulären Signalwegen dar. Bei schwerwiegenden Leberschäden, z.B. ASH und NASH, und einigen neurodegenerativen Krankheiten (z.B. Morbus Parkinson) liegt SQSTM1/p62 aufgrund fehlender Autophagie geschädigter Proteine in Aggregaten gemeinsam mit Ubiquitin in der Zelle vor. Bei NASH stellt SQSTM1/p62 einen Bestandteil der in Hepatozyten gebildeten zytoplasmatischen Mallory-Denk-Körperchen dar. Ziel dieser Studie war die Klonierung der humanen SQSTM1/p62 cDNA in einen geeigneten Vektor zur heterologen Expression des Proteins in E. coli und dessen Aufreinigung für nachfolgende NMR-Strukturstudien, um Bindedomänen und potentielle Bindungspartner des SQSTM1/p62 in den Mallory-Denk-Körperchen zu bestimmen, und um Redox-Charakterisierungen des Proteins zu ermöglichen. Die von dem humanen SQSTM1/p62 Gen abgeleitete cDNA konnte erfolgreich in das Plasmid pET-28a(+) inseriert werden, wodurch nach der Transformation von E. coli die heterologe Expression des SQSTM1/p62 und dessen Aufreinigung mittels ?Immobilized Metal Affinity Chromatography? ermöglicht wurde. Die Ausbeute an gereinigtem löslichen SQSTM1/p62 ist ausreichend für Redox-Charakterisierungen des Proteins, jedoch müsste zur Durchführung von NMR-Studien die Effizienz der Proteinreinigung gesteigert werden, um die Ausbeute an löslichem SQSTM1/p62 zu erhöhen.

Zusammenfassung (Englisch)

The human SQSTM1/p62 is a scaffold protein which binds different substrates through its various structural motifs and therefore plays an important role in several metabolic pathways in the human body. Particularly, damaged polyubiquitinated signaling proteins are bound intracellularly by SQSTM1/p62 and proapoptotic and prosurvival pathways are activated. Moreover, SQSTM1/p62 is involved in TNF-? signaling and the activation of the transcription factor NF-?B by linking RIP to PKC? and IKK-?. Additionally, it promotes polyubiquitination of TRAF6. The protein SQSTM1/p62 therefore represents a central hub in cellular signaling pathways. In severe liver damages, i.e. alcoholic (ASH) and nonalcoholic steatohepatitis (NASH), and several neurodegenerative disorders, like Parkinson?s or Alzheimer?s disease, SQSTM1/p62 can be found together with ubiquitin in protein aggregates within the cell, because there is no autophagy occurring in these cases. In NASH, SQSTM1/p62 depicts a component of cytoplasmatic inclusion bodies, called Mallory-Denk bodies, which are formed in hepatocytes. The aim of this study was to clone the human SQSTM1/p62 cDNA into a suitable vector for heterologous expression of the protein in E. coli and its purification for subsequent NMR structure studies in order to identify binding domains and potential binding partners of SQSTM1/p62 in Mallory-Denk bodies and for redox-characterization of the protein. The cDNA derived of the human SQSTM1/p62 gene could be successfully inserted into the plasmid pET-28a(+), which made, after the transformation of E. coli cells, the expression of the SQSTM1/p62 protein and its purification by ?Immobilized Metal Affinity Chromatography? possible. The amount of purified soluble SQSTM1/p62 is sufficient for redox characterization of the protein. To be able to perform NMR studies, the efficiency of the protein purification has to be increased in order to obtain a higher yield of soluble SQSTM1/p62.