Titelaufnahme

Titel
Synthesis and functional characterization of a fluorescent analogue of bromoenol lactone (BEL), an irreversible inhibitor of group vi calcium - independent phospholipase A2 <[A2 tief 2]> / Romana Schwarz
Verfasser/ VerfasserinSchwarz, Romana
Begutachter / BegutachterinLeis Hans-Jörg
Erschienen2010
UmfangXI, 77 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Phospholipase A2 / Phospholipase A2 / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-22399 Persistent Identifier (URN)
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Synthesis and functional characterization of a fluorescent analogue of bromoenol lactone (BEL), an irreversible inhibitor of group vi calcium - independent phospholipase A2 <[A2 tief 2]> [1.77 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

iPLA2s werden in die Gruppe VI der Phospholipasen A2 (PLA2s) eingeordnet. Diese Enzyme sind an einem Deacylierungs/Reacylierungs Zyklus von Membranphospholipiden in Zellen (Lands Zyklus) beteiligt. Demzufolge spalten iPLA2s Phospholipide an der sn-2 Position in Lysophosholipide und freie Fettsäuren (z.B. Arachidonsäure, AA). Dieses freigesetzte Lysophospholipid fungiert als Acyl-Akzeptor, welcher für den AA-Einbau in zelluläre Phospholipide wichtig ist. Die abgespaltene AA kann in weiterer Folge für die Prostaglandinsynthese verwendet werden. iPLA2s besitzen jedoch keine Substrat-Präferenz für die AA. Eine weitere Eigenschaft von iPLA2s ist, dass deren katalytische Aktivität unabhängig von Ca2+ ist. Es wurde eine inhibierende Wirkung von PBEL [3-(1-pyrenyl)-6-(E)-(bromomethylene)-tetrahydropyran-2-one] auf iPLA2s angenommen. PBEL ist ein Fluoreszenzfarbstoff, welcher nach einer abgeänderten und optimierten Methode für Bromoenol Lacton (BEL) nach Daniel et al. hergestellt wurde. Die inhibierenden Eigenschaften von PBEL auf die iPLA2 Aktivität wurden mittels [1-14C]AA-Einbau in Phospholipide in L929-Zellen und mittels einer Prostaglandinbestimmung in MC3T3-E1/B Zellen unter Kalzium-freien Bedingungen untersucht. L929-Zellen, welche mit PBEL und [1-14C]AA vorbehandelt wurden, zeigten eine erniedrigte exogene [1-14C]AA Einbau in Phospholipiden. Weiters zeigten MC3T3-E1/B Zellen nach PBEL und AA Vorbehandlung eine signifikante erhöhte Prostaglandinsynthese. Diese Ergebnisse bestätigen die angenommene inhibierende Wirkung von PBEL auf iPLA2s. Die intrazelluläre Lokalisierung von Gruppe VI iPLA2s war ebenfalls ein wichtiger Teil dieser Forschung. L929 und MC3T3-Zellen zeigten, nach der Behandlung mit PBEL, eine intrazelluläre Fluoreszenz, visualisiert durch inverse Fluoreszenzmikroskopie. Diese Fluoreszenz ist auf eine erfolgreiche zelluläre Aufnahme von PBEL und auf eine Interaktion zwischen PBEL und iPLA2 zurückzuführen.

Zusammenfassung (Englisch)

Calcium-independent iPLA2s belong to group VI of the phospholipases A2 (PLA2s), which are implicated in the deacylation/reacylation cycle of membrane phospholipids in cells (Lands cycle). Whereby phospholipids are cleaved by iPLA2s in the sn-2 position, generating lysophospholipids and free fatty acids. However group VI iPLA2s have no substrate preference for arachidonic acid (AA) and their catalytic activity does not require Ca2+. The generated lysophospholipid serves as an acyl-acceptor, appropiated for the incorporation of AA into cellular phospholipids. Moreover, released arachidonic acid can be converted into prostaglandins. An inhibiting effect of group VI iPLA2s by PBEL [3-(1-pyrenyl)-6-(E)-(bromomethylene)-tetrahydropyran-2-one] was suggested. PBEL is a fluorescent substance, synthesized according to a modified and optimized chemical synthesis method of Daniels et al. for bromoenol lactone (BEL). The inhibitory properties of PBEL on iPLA2 activity was carried out by a [1-14C]AA incorporation essay into phospholipids of L929-cells and by a prostaglandin determination of MC3T3-E1/B cells under calcium free conditions. L929-cells, pre-treated with PBEL and [1-14C]AA showed an inhibition effect in form of a decreased exogenous [1-14C]AA incorporation into phospholipids. This result was additionally verified by a significant increase of prostaglandin synthesis of MC3T3-E1/B cells, pre-treated with PBEL and AA. This study also focused on the determination of the intracellular localisation of group VI iPLA2s by PBEL. L929 and MC3T3-E1/B cells, pre-treated with PBEL showed an intracellular fluorescence, visualized by inverse fluorescence microscopy. This result reveals that PBEL was taken up by the cells and that an interaction between PBEL and iPLA2 appeared, detectable by its high fluorescence.