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Title
Determination of Superoxide anion by a HPLC Method in endothelial dysfunction induced by oxLDL
Additional Titles
Determination of Superoxide anion by a HPLC Method in endothelial dysfunction induced by oxLDL
AuthorKerner, Alexander
PublishedGraz, 2017
Institutional NoteKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2017
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Document typeMaster Thesis
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-116440 Persistent Identifier (URN)
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Determination of Superoxide anion by a HPLC Method in endothelial dysfunction induced by oxLDL [1.6 mb]
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Abstract (German)

Das Superoxid Anion (O2) ist ein Radikal biologischen Ursprungs, welches unter anderem von der NADPH Oxidase (Nicotinamidadenindinukleotidphosphat Oxidase), einem Membran-gebundenen Enzymkomplex, produziert wird. Alternativ kann O2 auch während pathophysiologischer Zustände durch die Entkopplung der NO-Synthase (NOS) produziert werden.Eine hochregulierte O2 Produktion spielt eine Schlüsselrolle in der Pathologie verschiedener kardiovaskulärer- und vaskulärer Dysfunktionen einschließlich der Entstehung von arteriosklerotischen Plaques.Das Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung und Optimierung einer HPLC-Methode um O2 Konzentrationen in Endothelzellen zu bestimmen.Es gibt etliche Methoden zur O2 Bestimmung in biologischen Proben, wobei bei den meisten Bestimmungen O2 nicht mit ausreichender Spezifität detektiert werden kann.Eine Methode zur O2 Messung, die bereits zuvor in der Literatur beschrieben worden ist, wurde etabliert. Sie beruht auf der durch O2 induzierten Reduktion von Dihydroethidium (DHE) zu 2-Hydroxy-Ethidium. Die Trennung vom ebenfalls gebildeten Ethidium durch HPLC erlaubt eine hochspezifische Bestimmung von 2-Hydroxy-Ethidium und damit O2.Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Verwendung der Methode zur Bestimmung von O2 in der durch oxidiertes Lipoprotein (oxLDL) induzierten endothelialen Dysfunktion in EA.hy 926 Zellen. Die Handhabung von DHE unter Zellkulturbedingungen, Methoden zur Extraktion des DHEs und die Aufbereitung der Proben optimiert. Es wurden O2 Messungen unter Einwirkung diverser Substanzen, unter anderem auch oxLDL, durchgeführt. Es konnte deutlich gezeigt werden, dass oxLDL eine erhöhte O2 Produktion durch Entkoppeln der eNOS induziert.Im Rahmen der Masterarbeit wurde eine Routine-Methode zur O2 Bestimmung in kultivierten Zellen etabliert und ihr Einsatz unter simulierten pathophysiologischen Bedingungen getestet.

Abstract (English)

The superoxide anion (O2) is a biological radical which e.g.: can be formed by NADPH oxidase (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase), a membrane-bound enzyme complex. Alternatively, O2 can also be formed in pathophysiological situations by uncoupling of nitric oxide synthase (NOS).Enhanced O2 formation plays a key role in the pathology of numerous cardiovascular and vascular dysfunctions including arteriosclerotic plaque formation.The primary aim of this thesis was to establish an optimized high performance liquid chromatography (HPLC) method capable of measuring intracellular O2 concentrations in endothelial cells. There are numerous methods for determination of O2 produced in biological samples. However, most of these methods contain pitfalls in the specificity for O2. We established a method described in literature based on the reduction of dihydroethidine (DHE) to 2-hydroxy-ethidium by O2 with simultaneous separation of the coformed ethidium by HPLC. This method enables a highly specific determination of O2. Other methods and their pitfalls used for O2 determination are also described in the introduction section.The second part and second aim of this thesis was to utilize the established sensitive and specific method for O2 determination in endothelial dysfunction induced by oxidized low density lipoprotein (oxLDL). Handling of DHE under cell culture conditions, extraction procedures for DHE and sample preparation for HPLC were optimized. Finally, measurements of O2 under the influence of various agonists of endothelial NOS (eNOS) were performed including oxLDL. It could be clearly demonstrated that oxLDL enhances O2 formation by inducing uncoupling of eNOS.In summary, a routine method for determination of O2 in cultured cells was established and its application under simulated pathophysiological conditions tested.