Titelaufnahme

Titel
Analysis of structures relevant for permeation and gating in TRPC3 / vorgelegt von Michaela Lichtenegger
Verfasser/ VerfasserinLichtenegger, Michaela
Begutachter / BegutachterinGroschner Klaus
Erschienen2010
Umfang57 Bl. : Zsfassung ; graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Dipl.-Arb., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (GND)Calciumkanal / Permeation / Calciumkanal / Permeation / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-17045 Persistent Identifier (URN)
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Analysis of structures relevant for permeation and gating in TRPC3 [1.03 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die vorliegende Diplomarbeit beschäftigte sich mit der Aufklärung von Strukturen mit funktioneller Bedeutung für Gating- und Permeationseigenschaften des Kationenkanals TRPC3, ein in Säugetieren vorkommender Vertreter der TRP-Kanal Familie (Transient-Receptor-Potential Channels).Das TRPC3 Kanalprotein besteht aus sechs Transmembran-Domänen wovon TM5, TM6 und deren verbindende Schleifen vermutlich die Porenregion formen. Hypothetischen Modellen zu Folge, säumt jenes helicale Verbindungsstück den unmittelbaren Permeationsweg und wird daher als potentieller Selektivitätsfilter betrachtet, dessen Schlüsselelemente negativ geladene Aminosäuren darstellen. Punktmutationen wurden durch ortsspezifische Mutagenese eingeführt, die Mutanten des Kanals in HEK293 Zellen exprimiert und schließlich unter Anwendung der Patch-clamp Technik charakterisiert.Der Austausch von Glutamat630 gegen Glutamin resultierte in einem Kanal mit komplett veränderter Strom-Spannungs Charakteristik und deutlich reduzierter Permeabilität für Barium, während die Einführung von Lysin an besagter Stelle die Bildung eines funktionsunfähigen Kanals bewirkte. Diesen Ergebnissen zu Folge scheint Glu630 eine bedeutende Rolle im Permeationsverhalten von TRPC3 zu spielen.Eine weitere Neutralisationsmutation von Glutamat616 resultierte in einem funktionsunfähigen Kanal mit fehlender Sensitivität für Carbachol. Glu616 scheint demnach für die Phospholipase-C abhängige Aktivierung des Kanals von Bedeutung zu sein.Im Gegensatz dazu, bewirkte der Austausch von Glutamat644 gegen Lysin oder Glutamin keine signifikante Veränderung der Permeationseigenschaften. Diese Resultate bestätigen in erster Linie die hypothetische Lokalisation von Glu644 im hydrophoben Bereich des Kanalproteins und schließen in der Folge einen Beitrag besagter Aminosäure zur Permeationscharakteristik von TRPC3 aus.

Zusammenfassung (Englisch)

This study set out to identify structures that are relevant for permeation and gating in the cation channel TRPC3. Point mutations were introduced by side-directed mutagenesis and whole-cell voltage clamp recordings were made from HEK293 cells, transfected either transiently or stably with wild-type TRPC3 or mutated channels. TRPC3 consists of six hydrophobic membrane spanning regions of which transmembrane segment 5 and 6 are likely to form the central pore region. According a hypothetical model of the TRPC3 pore structure, the short helical loop between TM5 and TM6, which lines the immediate permeation pathway, might constitute the selectivity filter. Several negatively charged amino acid residues (glutamate and aspartate) within this loop are potential key-elements of this selectivity filter, which governs permeation of TRPC3.The results of the present study show that neutralization of glutamate to glutamine at position 630 of TRPC3 generates a channel with completely altered current-voltage relationship and significantly decreased barium permeability. By contrast, introduction of positively charged lysine at position 630 eliminated channel function. In essence, these findings demonstrate the great importance of E630 as part of the permeation pathway of TRPC3. A glutamate-to-glutamine mutation at position 616 resulted in a nonfunctional channel, which does not longer respond to carbachol. Thus glutamate at position 616, hypothetically located at the outer pore vestibule, appears to be important for PLC-mediated TRPC3 activation.Moreover, exchange of negatively charged glutamate to either neutral glutamine or positive lysine at position 644 did not have any significant effect on permeation properties, confirming the hypothetical localization of E644 within the hydrophobic region of the TRPC3 complex, which excludes a participation in ion permeation within TRPC3.