Titelaufnahme

Titel
Determination of calcium - independent phospholipase A2 activity in osteoblastic cell lines / Sonja Charlotte Maitzen
Verfasser/ VerfasserinMaitzen, Sonja Charlotte
Begutachter / BegutachterinLeis Hans-Jörg
Erschienen2010
Umfang61 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2010
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Phospholipase A2 / Calcium / Osteoblast / Phospholipase A2 / Calcium / Osteoblast / Online-Publikation
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-15265 Persistent Identifier (URN)
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Determination of calcium - independent phospholipase A2 activity in osteoblastic cell lines [0.92 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Phospholipase A2 hydrolysiert Phospholipide an der sn-2 Position . Diese katalytische Reaktion führt zu Bildung einer freien Fettsäure und einem Lysophospholipid.. In der Zelle sind diese Produkte in Second Messenger Aktivitäten beteiligt. Die meisten PLA2 sind durch Ca2+ reguliert. Die Gruppe der iPLA2 benötigen kein Ca2+ um aktiv zu sein und zusätzlich zeigen sie keine Substratspezifität. Aus diesem Grund wurden ihnen zunächst housekeeping Funktion in der Zelle zugeschrieben und keine regulatorische Funktion.In den Zellen des Knochens wurden die Beteiligung von PLA2 an regulatorischen Prozessen beschrieben, die zur Freisetzung von Arachidonsäure führen. Hingegen ist über die Beteiligung von iPLA2 bis jetzt noch nichts bekannt. Die Zielsetzung diese Masterarbeit war die Etablierung einer Methode die auf dem katalytischen Umsatz von radioaktiv markierten Phosphatidylcholin basiert, um iPLA2 Aktivität in osteoblastischen Zellen zu determinieren. Der Assay wurde etabliert um unter den selektiven Assaybedingungen (Ca2+ frei) spezifisch iPLA2 Aktivität zu messen in Anlehnung an die Arbeit von Yang et al. Diese Methode wurde weitgehend modifiziert um in osteoblastische Zellen zwischen der cytosolischen und membran gebundenen Form des Enzymes zu unterscheiden. Die Evaluierung des Assays beinhaltete die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, Handhabung der Proben, Zeitkinetiken und Probenstabilität. Die Reproduzierbarkeit der Probenmessungen innerhalb eines Experimentes ist <5%, größere Unterschiede wurden bei Tag zu Tag vergleichen identifiziert.Die Spezifität der iPLA2 Aktivität wurde mittels BEL. Zudem wurden Western blot Analysen für iPLA2? durchgeführt um die gemessenen Aktivitäten iPLA2 ? und iPLA2? zuzuordnen.Im Zuge dieser Masterarbeit wurde zum ersten Mal iPLA2? und iPLA2? Aktivität in Osteoblasten gemessen und beschrieben. Zudem wurde zusätzlich das Vorkommen von iPLA2? und iPLA2? Aktivität demonstriert.

Zusammenfassung (Englisch)

Phospholipase A2 are enzymes that hydrolyse phospholipids at the sn-2 position. The catalytic reaction leads to the generation of a free fatty acid and a lysophospholipid. Both of these products are involved in second messenger activities in the cell. There are several distinct PLA2s, most of them are regulated by Ca2+. The calcium-independent PLA2s (iPLA2) do not require Ca2+ for their activity and additionally do not show substrate specificity, like most of the PLA2s. Therefore they have been suggested mainly to have housekeeping function in the cell and do not contribute as regulatory proteins.In bone cells the involvement of PLA2s in the regulatory processes leading to arachidonate release have been described, but not for iPLA2. This master thesis aimed at establishing a method, based on the catalytic turnover of a radio labelled phosphatidylcholine, to measure iPLA2 activity in osteoblastic cells. The iPLA2 assay was established to specifically measure iPLA2 under the chosen conditions (Ca2+ free) according to the procedure of Yang et al. It was further modified for the measurement of osteoblastic cell lines to be able to distinguish between cytosolic (iPLA2?) and membrane-bound (iPLA2?) derived enzyme activity. Evaluation of the assay included reproducibility, sample treatment, time course experiments and sample stability. Reproducibility of the assay within one set of experiments was found to be <5%, larger variations were found for day to day reproducibility. The specificity of the measured iPLA2 activity was evaluated by the use of BEL, a specific iPLA2 inhibitor. Western blot analysis for iPLA2? was performed to assign measured activities to iPLA2 ? and iPLA2 ?, respectively.In the course of this thesis iPLA2 activity in osteoblasts has been measured and described for the first time. Moreover, the presence of both, iPLA2? and iPLA2? activity was demonstrated.