Titelaufnahme

Titel
Structural and mechanistic studies on aldolases, oxidoreductases and nitrilases / by Michael Karl Uhl
Weitere Titel
Structural and mechanistic studies on aldolases, oxidoreductases and nitrilases
Verfasser/ VerfasserinUhl, Michael Karl
Begutachter / BegutachterinGruber, Karl ; Zangger, Klaus
Erschienen2009
UmfangXIV, 111, V Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Diss., 2009
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (GND)Enzym / Biokatalyse / Strukturanalyse
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-11879 Persistent Identifier (URN)
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Structural and mechanistic studies on aldolases, oxidoreductases and nitrilases [8.4 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Durch die Vielfältigkeit von enzymkatalysierten Reaktionen und die Fähigkeit von Enzymen unter milden Bedingungen zu arbeiten, gewinnen Enzyme im Bereich der Katalyse zunehmend an Bedeutung. Um Enzymaktivitäten, aber auch die Stabilität und Selektivität von Enzymen zu erhöhen, kommen unterschiedlichste Methoden, wie zum Beispiel die PCR (Polymerasekettenreaktion) error-prone Technik zum Einsatz. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass Mutationen nicht spezifisch, sondern statistisch verteilt eingeführt werden, weshalb keine genauen Wirkungsvorhersagen möglich sind. Im Unterschied dazu, kann man bei zielgerichteten Mutationen bestimmte mechanistisch relevante Aminosäuren gezielt austauschen (man weiß, was man tut!). Zielgerichtete Mutationen benötigen jedoch ein bestimmtes Maß an strukturellem Vorwissen. Aus diesem Grund ist die Strukturaufklärung ein wichtiger Bestandteil von rationellem Enzymdesign. Die Arbeit im Rahmen dieser Dissertation beschäftigte sich hauptsächlich mit der Kristallisation und Strukturbestimmung von biokatalytisch wichtigen Enzymen und wurde innerhalb des Zentrums für Angewandte Biokatalyse durchgeführt. Enzyme aus vier unterschiedlichen Enzymklassen (L-Threonin Aldolasen, D-Threonin Aldolasen, old yellow enzymes und Nitrilasen) sollten kristallisiert und in weiterer Folge strukturell charakterisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen wurden verschiedene Kristallisationsmethoden und Techniken angewendet. Im Zuge dieser Arbeit war es möglich von zwei der verwendeten Enzyme die Struktur zu bestimmen. Neben der Kristallisation kamen zusätzlich noch biophysikalische Charakterisierungsmethoden wie zum Beispiel die Fluoreszenzspektroskopie, aber auch in-silico Techniken wie das Docking von Enzym-Substrat Komplexen zum Einsatz.

Zusammenfassung (Englisch)

Enzymes gain more and more importance in the field of bio-catalysis due to their ability to catalyze various reactions under mild conditions with high regio- and enantio-selectivity. To improve enzyme activity, stability or selectivity towards very often unnatural substrates different mutagenesis techniques are applied like PCR error-prone approaches. The drawback involving such methods is that mutations are inserted accidentally at random position. A rational design approach (site-directed mutagenesis) of mutants in contrast requires structural knowledge of the enzyme but benefits from distinct mutagenesis sites. You know what you are doing; at least you expect to know it (marginal changes of the amino acid composition could have vast effects on the global protein properties). To gain structural knowledge is therefore the key step for rational design approaches of enzymes with respect to their properties.The present thesis was mainly focused on the crystallization and structure determination of enzymes (in cooperation with mutagenesis studies) which are important for bio-catalytic application within the Centre of Applied Biocatalysis. Four enzyme classes (L-threonine aldolases, D-threonine aldolases, old yellow enzymes and nitrilases) from different sources performing different reactions were used as crystallization targets. To achieve crystallization events different approaches were used, protocols developed and alternative paths were followed. (e.g. high throughput crystallization at the EMBL). Two enzyme structures could be successfully determined and were investigated regarding the reaction mechanism and enzymatic structure-function relationships. The biophysical characterization was done employing laboratory work (circular dichroism, fluorescence spectroscopy, and others) as well as in-silico approaches (calculation of electrostatic potentials, docking, ?).

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