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Titel
Klonierung und biochemische Charakterisierung von potentiellen, hautspezifischen Lipasen / Susanne Grond
Verfasser/ VerfasserinGrond, Susanne
Begutachter / BegutachterinLass Achim
Erschienen2010
UmfangVII, 106 Bl. : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2010
SpracheDeutsch
DokumenttypMasterarbeit
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-11261 Persistent Identifier (URN)
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Klonierung und biochemische Charakterisierung von potentiellen, hautspezifischen Lipasen [2.76 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Protein ?Comparative gene identification 58?(CGI-58) spielt eine wichtige Rolle in der Lipolyse, indem es die Aktivität der ?Adipose Triglyceride Lipase?(ATGL), dem limitierenden Enzym im Triglyzerid(TG)-Katabolismus, stimuliert. Mutationen in ATGL und in CGI-58 führen zur Entstehung von ?Neutral Lipid Storage Disease?(NLSD), die durch exzessive Akkumulation von TG in vielen Geweben charakterisiert ist. Interessanterweise leiden NLSD-Patienten, die Mutationen in CGI-58 aufweisen, zusätzlich an Ichthyose, einer schweren Hauterkrankung. Dies deutet auf eine zusätzliche Funktion von CGI-58 in der Haut hin. Untersuchungen an CGI-58 defizienten Mäusen zeigten, dass CGI-58 limitierend für den epidermalen TG-Katabolismus ist. Dies führte zur Hypothese, dass CGI-58 in der Haut eine noch unbekannte TG-Lipase stimulieren könnte. In dieser Arbeit wurden 10 potentielle, hautspezifische Lipasen identifiziert und biochemisch charakterisiert. In in vitro TG-Hydrolase-Aktivitätsbestimmungen unter neutralen Bedingungen(pH 7,4) konnte keine TG-Lipase, die zudem CGI-58 stimulierbar gewesen wäre, identifiziert werden. Hingegen konnten unter sauren pH-Bedingungen(pH 5,0) sowie in in vivo Zellexperimenten moderate TG-Hydrolase-Aktivitäten einiger Kandidatenproteine nachgewiesen werden, die aber nicht durch CGI-58 stimulierbar waren. In zusätzlichen Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Kandidatenprotein NM_197999 künstliche Esterasesubstrate, Monoglyzeride, Cholesterinester, Retinylester und Epoxide hydrolysiert, wobei die Aktivität gegenüber Epoxide am ausgeprägtesten war. Diese biochemischen Eigenschaften stimmten weitgehend mit denen des zu 83% homologen Proteins Ces5 überein. Für NM_197999 konnte weiters ein neutrales pH-Optimum bestimmt, sowie eine Lokalisation am Endoplasmatischen Retikulum gezeigt werden. Genexpressionsanalysen zeigten weiters, dass NM_197999 vorwiegend in Haut und Zunge exprimiert wird, während Ces5 vorwiegend in der Leber exprimiert wird.

Zusammenfassung (Englisch)

The protein comparative gene identification 58 (CGI-58) plays a major role in lipolyis by stimulating the enzymatic activity of adipose triglyceride lipase (ATGL), the rate limiting enzyme in triglyceride (TG) catabolism. Mutations in ATGL as well as in CGI-58 lead to the development of neutral lipid storage disease (NLSD), which is characterised by the excessive accumulation of TG in multiple tissues. Interestingly, patients with NLSD, caused by mutations in CGI-58, also suffer from ichthyosis, a severe skin defect.These observations indicate an ATGL-independent function of CGI-58 in the skin. The characterisation of CGI-58 knock out mice indicated that CGI-58 is limiting for the epidermal TG catabolism. This led to the hypothesis that CGI-58 might activate a currently unknown TG-lipase in the skin. In this work ten potential, skin specific lipases have been cloned and biochemically characterised. None of the candidate proteins exhibited in vitro TG hydrolase activity under neutral conditions (pH 7,4) and were not be stimulated by CGI-58. However, under acidic conditions (pH 5,0) and in in vivo cell experiments moderate TG hydrolase activities were found which were not stimulated by CGI-58. In further experiments we found that the candidate protein NM_197999 hydrolyzes synthetic esterase substrates, monoglycerides, cholesterol esters, retinyl esters and epoxides. The reactivity of NM_197999 against the latter was most pronounced. The protein Ces5, which is to 83% homologue to NM_197999, showed almost identical biochemical characteristics. Moreover, NM_197999 was most active at neutral pH and localised to the endoplasmic reticulum. Gene expression analysis revealed that NM_197999 is mainly expressed in skin and tongue whereas Ces5 is mainly expressed in liver.