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Title
Development of novel fluorescent protein based biosensors to dynamically visualize mitochondria associated membranes (MAMs) on the single cell level
Additional Titles
Development of novel fluorescent protein based biosensors to dynamically visualize mitochondria associated membranes (MAMs) on the single cell level
AuthorRamadani, Jeta
CensorMayer, Bernhard-Michael
PublishedGraz, 2017
Institutional NoteKarl-Franzens-Universität Graz, Diplomarbeit, 2017
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Document typeThesis (Diplom)
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-115399 Persistent Identifier (URN)
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Development of novel fluorescent protein based biosensors to dynamically visualize mitochondria associated membranes (MAMs) on the single cell level [1.57 mb]
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Abstract (German)

Trotz der Entwicklung vieler Methoden und verschiedener Herangehensweisen zur Untersuchung der sogenannten Mitochondrien assoziierten Membranen (MAMs), ist tatsächlich nur sehr wenig über die Dynamik, Entstehung und den Abbau dieser Subkompartimente bekannt. Ein exzellenter Ansatz, um verschiedene Vorgänge in in einzelnen Zellen zu visualisieren bieten genetisch kodierte, fluoreszierende Sensoren an. Diese Arbeit erläutert die Entwicklung von neuen auf Förster -Resonanzenergietransfer (FRET) und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung basierter genetisch kodierter Sensoren (GKS) für die Visualisierung und dynamische Messungen der MAMs in Echtzeit. Wir haben eine Palette an neuen, unterschiedlichen MAMs-Sensoren designt und entwickelt, die jeweils an der äußeren mitochondriellen Membran und an der ER-Oberfläche lokalisiert sind. Erste Messungen mit den MAMs-Sensoren haben ergeben, dass nur eine kleine Fraktion (Subdomänen) der beiden Organellen tatsächlich in Interaktion treten, um MAMs unter physiologischen Bedingungen zu formieren. Für weitere Untersuchungen mit den Sensoren, nutzten wir eine Zelllinie von embryonalen Maus-Fibroblasten, die ein Mfn2-Knockout aufweisen. Es wird angenommen, dass Mifosuin2 eine entscheidende Rolle bei der MAMs-Bildung einnimmt und somit veränderte MAMs-Strukturen bei dem Knockout-Zellmodel zu beobachten sind. Dieser Ansatz soll eine neue Möglichkeit bieten, um die komplexe Entstehung und Auflösung der MAMs unter (patho)-physiologischen Bedingungen zu untersuchen und zu verstehen.

Abstract (English)

Despite the availability of sophisticated methods and approaches for the investigation of mitochondria associated membranes (MAMs), little is known, if any, about the dynamic regulation and formation/degradation of these organelle contact sides in a real-time manner. An excellent approach to visualize cellular events on the level of individual cells offer genetically encoded fluorescent sensors (GES). Hence, in this diploma thesis we attempted to develop a novel approach to visualize MAMs in live. For this purpose, we designed and generated a palette of various novel putative MAMs sensors that were differentially targeted to the ER surface and outer mitochondrial membrane. First application of these probes in HeLa cells combined with co-labeling unveiled that only a small fraction of these two organelles are in interaction to form MAMs under physiological conditions. In order to probe these novel sensors, we utilized a cell model of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and a respective Mfn2-/- variant that is supposed to display an altered MAMs tethering. This approach builds the basis to further develop and refine fluorescent protein- (FP) based techniques to visualize MAMs with high spatial and temporal resolution