Titelaufnahme

Titel
Studies of micelle-bound peptides using paramagnetic relaxation enhancement / Michal Respondek
Verfasser/ VerfasserinRespondek, Michal
Begutachter / BegutachterinZangger, Klaus ; Gruber, Karl
Erschienen2008
UmfangGetr. Zählung : Zsfassung ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Diss., 2008
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)NMR Spektroskopie / paramagnetische Relaxationsbeschleunigung / DPC Mizellen / Gd(DTPA-BMA) / ParaPos / Paramagnetic Relaxation Wave / Peptide / Diffusion / CM15 / TM7
Schlagwörter (EN)NMR spectroscopy / Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE) / DPC micelles / Gd(DTPA-BMA) / ParaPos / Paramagnetic Relaxation Wave / Peptides / Diffusion / CM15 / TM7
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-79 Persistent Identifier (URN)
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Studies of micelle-bound peptides using paramagnetic relaxation enhancement [29.32 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Viele Peptide, Proteine Natur- und Wirkstoffe binden an biologische Membranen. Um deren Funktion auf molekularer Ebene zu verstehen ist es notwendig deren Topologie in der Membran zu kennen. In dieser Dissertation werden neue Lösungs-NMR Methodiken präsentiert um die Orientierung und Lokalisierung von helikalen Peptiden in einem Membranmimetikum zu bestimmen. Durch die Messung von Protonen T1 Relaxationsraten während einer Titration mit einer paramagnetischen Sonde erhält man ein wellenförmiges Muster mit einer Periodizität von 3.6 Aminosäurenresten pro Welle. Ich benutzte hierzu die wasserlösliche paramagnetische Substanz Gd(DTPA-BMA) da diese keine Wechselwirkungen mit Proteinen zeigt. Die Relaxationsraten bei unterschiedlichen Konzentrationen der paramagnetischen Substanz wurden aus Kreuzsignalen von saturation-recovery 2D NOESY und 2D TOCSY Spektren erhalten. Untersucht wurden das 15 Aminosäuren antimikrobielle Peptid CM15 und das aus 25 Aminosäuren bestehende Peptid TM7, welches die transmembran Helix 7 der V-ATPase aus Hefe darstellt. Beide Peptide wurden in unmarkierter Form untersucht. Aus dem erhaltenen Wellenmuster der paramagnetischen Relaxation können der Rotationswinkel (Azimuth) und der Drehwinkel (Tilt) ermittelt werden. Die Lokalisierung innerhalb der Mizelle (Eindringtiefe) wurde mittels des ParaPos Verfahrens erhalten. Dabei werden experimentelle paramagnetische Relaxationsratenerhöhungen (PREs) von Protonen korreliert mit deren Eindringtiefe nach Kalibration an einem System bekannter Topologie - im speziellen Fall der transmembran Helix TM7. Die Orientierung und Eindringtiefe von TM7 und CM15 wurden durch least-square fitting der experimentellen PREs berechnet. Die präsentierte Methode ermöglicht die Bestimmung der Orientierung und Lokalisierung eines Peptides in einer Mizelle auch an unmarkierten Molekülen ohne kovalente Modifikation des Peptides und eröffnet die Möglichkeit die Topologie auch anderer mizell-gebundener Substanzen zu ermitteln.

Zusammenfassung (Englisch)

Many peptides, proteins, natural compounds and drugs bind to biological membranes. Determining their topology is crucial in understanding their function and activity on a molecular level. Here new solution state NMR methods for obtaining the complete orientation and location of helical peptides in a membrane-mimetic environment (micelle-bound) are presented. By monitoring proton T1 - relaxation rates during a titration with a paramagnetic surface probe, a wave-like pattern with a periodicity of 3.6 residues per turn was obtained. The water-soluble paramagnetic agent Gd(DTPA-BMA) was used due to its reported absence of interactions with proteins. The relaxation rates at different concentrations of the paramagnetic compound were derived from the cross-peaks of saturation-recovery 2D-NOESY and 2D-TOCSY spectra on the antimicrobial fifteen residues peptide CM15 and the twenty five residues peptide TM7 that mimics the Vph1p transmembrane helix 7 of yeast V-ATPase, both in unlabeled form. The obtained wave-like pattern, the paramagnetic relaxation wave, allows the determination of the rotation (azimuth) and tilt angle of the helix. The location of the peptides in terms of their immersion depths was obtained based on the ParaPos approach. The measured paramagnetic relaxation enhancements (PREs) of protons were correlated with their micellar immersion depths after calibration using a system of known topology, in this case a transmembrane helical peptide TM7. The orientation and immersion depth of the TM7 and CM15 peptides were then obtained by least-square fitting of measured versus calculated PREs.The presented methods enable the complete orientation and location of the peptide in the micelle to be obtained even on unlabeled peptides by one simple experiment that does not require any covalent modifications of the peptide. The approaches also open a path towards the topology determination of any structurally characterized micelle bound molecule.