Bibliographic Metadata

Title
The impact of HMGB1 isoforms on chondrocyte metabolism : evaluation of the multi-functional protein HMGB1 as a therapeutic target in Osteoarthritis and its role in disease progression / submitted by Teresa Lassacher, BSc
AuthorLassacher, Teresa Maria
CensorHutter, Heinz
PublishedGraz, 27.03.2017
Description90 Blätter : Illustrationen
Institutional NoteKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2017
LanguageEnglish
Document typeMaster Thesis
Keywords (GND)Arthrose / Proteine
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-111816 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
Files
The impact of HMGB1 isoforms on chondrocyte metabolism [2.37 mb]
Links
Reference
Classification
Abstract (German)

Arthrose ist die am häufigsten auftretende rheumatische Erkrankung und stellt ein erhebliches gesundheitliches Problem dar. Arthrose betrifft hauptsächlich stark belastete Gelenke wie Knie-, Hüft-, oder Fingergelenke und kommt vor allem bei Personen mit fortgeschrittenem Alter, Übergewicht oder Bewegungsmangel vor. Pathophysiologisch stehen der schrittweise Abbau von Gelenksknorpelmatrix, Schädigungen der Chondrozyten und Entzündung der Gelenkskapsel im Vordergrund. Arthrose ist außerdem mit starken Schmerzen verbunden. Momentan stehen noch keine Medikamente zur Verfügung, die den Gelenksabbau längerfristig hemmen oder zur Heilung der Gelenkskrankheit führen.Daher wird ein besseres Verständnis des Ursprungs und der Pathogenese von Arthrose benötigt, um effektive Therapiemaßnahmen zu setzen.Das vielseitige Protein HMGB1 (high mobility group box protein) wurde bereits mit einer Vielzahl von Entzündungskrankheiten in Zusammenhang gebracht, unter anderem auch mit Arthrose. HMGB1 kommt im Körper in drei verschiedenen Isoformen vor, die sich in der Redoxform dreier konservierter Cysteinreste unterscheiden und je nach Konformation unterschiedliche immunologische Funktionen ausüben (chemotaktisch, Cytokin-induzierend, immuntolerant). Daher stellt dieses Protein ein höchst interessantes, potentielles Target zur Behandlung von Arthrose dar.Das Hauptaugenmerk dieses Projektes liegt in der Erforschung der Auswirkungen der unterschiedlichen HMGB1 Isoformen auf den Knorpelzell-Stoffwechsel (hinsichtlich Fortschreiten der Arthrose und Regeneration von arthrotischem Knorpelgewebe). Dafür wurden Zellexperimente mit zwei verschiedenen humanen Zelllinien durchgeführt, einerseits mit gesunden Knorpelzellen und andererseits mit arthrotischen Knorpelzellen. Knorpelzellen wurden als dreidimensionale, gewebsähnliche „Pellets“ kultiviert, um mit den verschiedenen HMGB1 Isoformen angeregt zu werden. Danach wurden die angeregten Zellpopulationen auf Veränderungen in ihrem Proliferationsverhalten (MTT-Assays), Stoffwechselaktivität (Messung der Aktivität bestimmter Gene assoziiert mit Knorpel-Stoffwechsel mittels RT-qPCR), Ausschüttung von Cytokinen (CBA-Facs), sowie auf Gewebsveränderungen (Histologie) untersucht. Die Untersuchungen ergaben, dass die Behandlung der Knorpelzellen mit den verschiedenen HMGB1 Isoformen keinen signifikanten Einfluss auf ihr Proliferationsverhalten hatte. Die Stimulationsexperimente zeigten, dass die Cytokin-induzierende Isoform (DS-HMGB1) ähnliche pathogene Effekte wie das proinflammatory Cytokin IL-1 auf beiden Knorpelzellarten ausübte. Bei der Behandlung der arthrotischen Knorpelzellen mit den anderen zwei Isoformen (SH- und SO3-HMGB1), wurden duale Effekte hinsichtilich des Knorpelzellstoffwechsels beobachtet. Es wurde dabei einerseits eine erhöhte katabole Aktivität gemessen (MMP-13, Col-10), welches auf eine pathogene Rolle in der Krankheitsentwicklung von Arthrose hindeuten würde; andererseits kam es aber auch zu erhöhter anaboler Aktivität (Sox-9), welche mit potentiell eingeleiteten Reperaturmechanismen in Zusammenhang stehen könnten.Die Ergebnisse sind äußerst interessant, jedoch vorläufig und statistisch nicht signifikant (aufgrund einer zu geringen Anzahl an Experimenten). Daher müssen die Experimente dringend wiederholt und validiert werden um konkretere Schlüsse aus den Effekten von HMGB1 auf Knorpelgewebe ziehen zu können.

Abstract (English)

Background and aims:Osteoarthritis (OA) is a rheumatic disease of the joint characterized by covert inflammation and degradation of the articular cartilage and the adjacent joint tissues resulting in functional impairment and pain. It is the most common form of arthritis, representing a major health problem as it affects approximately 15% of todays population. Current treatments are unable to inhibit cartilage degradation, thus there is a great need for developing new therapeutics to improve clinical outcomes. However, to enable an effective treatment of OA, a better understanding of disease origin and progression is needed.The multifunctional protein high mobility group box 1 (HMGB1) is known to play an important role in many inflammatory diseases and its contribution to OA pathophysiology has been reported in several studies. HMGB1 exerts different immunological functions (chemotactic, cytokine-inducing and immune-silencing), depending on the redox status of three conserved cysteine residues. Thus, HMGB1 represents a highly interesting target in OA therapy. In this project, the emphasis is on investigating the effect of the different isoforms of HMGB1 on chondrocyte metabolism and on elucidating potential regenerative properties of the isoforms and their role in OA pathology.Methods:In vitro studies were performed with primary human healthy chondrocytes (from the European Cell Culture Collection) and primary human chondrocytes from OA patients undergoing total knee replacement.Cells were grown in three dimensional (3D) pellet cultures, enabling the cells to form cartilage-like tissue, and stimulated with different HMGB1 isoforms. Proliferation and cytotoxicity was investigated by means of MTT-assays; Gene expression analyses were performed via RT-qPCR to investigate the effect of HMGB1 on the matrix metabolism; and cytometric bead array (CBA) analysis was carried out to measure their effect on proinflammatory cytokine release in chondrocytes. Furthermore, pellet cultures treated with different HMGB1 isoforms were analysed by histology in order to detect potential structural changes, as well as by immunohistochemistry to analyse the presence and localization of HMGB1.Results and outlook:Proliferation analysis showed that stimulation with HMGB1 isoforms did not affect the proliferation behaviour of chondrocytes significantly. Stimulation experiments showed potential pathogenic effects in both healthy and OA chondrocytes exerted by DS-HMGB1, which followed the trend of the pro-inflammatory cytokine IL-1-. Treatment of OA chondrocyte pellets with SH- and SO3-HMGB1 isoforms resulted in dual effects, indicated by an upregulation of the matrix degradation marker MMP-13 and at the same time an increased expression of the anabolic transcription factor Sox-9, which might indicate initial ongoing changes in the regulation of chondrogenesis associated processes.Future studies aim at repeating and validating this preliminary study in order to get conclusive results and to be able to identify the gene expression pattern specific for the different isoforms of HMGB1 in OA pathology and chondrocyte metabolism.