Titelaufnahme

Titel
Fine-tuning of recombinant horseradish peroxidase production in Pichia pastoris / Patricia Knabl, BSc
Weitere Titel
Fine-tuning of recombinant horseradish peroxidase production in Pichia pastoris
Verfasser/ VerfasserinKnabl, Patricia
ErschienenGraz, Oktober 2016
Umfang90 Blätter : Diagramme
HochschulschriftKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung des Verfassers/der Verfasserin
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Pichia pastoris / Genexpression / Proteine
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-108520 Persistent Identifier (URN)
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Fine-tuning of recombinant horseradish peroxidase production in Pichia pastoris [4.78 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris (Komagataella phaffii) ist ein weit verbreiteter mikrobieller Wirt zur Expression heterologer Proteine. Sie weist einige Vorteile auf wie etwa dass sie leicht genetisch zu manipulieren ist und post-translationale Modifikationen durchführen kann. P. pastoris erleichtert sekretorische Protein Produktion, da sie selbst wenig endogenes Protein in das Medium abgibt, was in Folge das downstream processing erleichtert.Jedoch ist P. pastoris‘ sekretorischer Weg ein bekannter Engpass in der Produktion von sekretorischen Proteinen und limitiert daher die Ausbeute des Zielproteins. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Leistung des sekretorischen Weges zu steigern. Proteine, die sekretiert werden, brauchen eine Signalsequenz welche die Translokation in das ER bewirkt. Eine der häufigsten verwendeten Signalsequenzen ist das Prepro Peptid des S. cerevisiae -mating Faktors (MF). Jedoch gibt es unterschiedliche Signalsequenzen welche statt MF verwendet werden können, die unter Umständen besser geeignet sind. Im Fall der sekretorischen Produktion von Horseradish peroxidase wurde in dieser Arbeit mit der eigenen P. pastoris saure Phosphatase pre-Sequenz in Kombination mit der S. cerevisiae Prosequenz einer MF Deletionsmutante die beste HRP Ausbeute erreicht. Zusätzlich wurden Helfer Proteine, die im unfolded protein respone (UPR) und ER-associated degradation (ERAD) beteiligt sind, sowie der Transkriptionsfaktor Hac1 wurden überexprimiert, um ihr Potential in der Unterstützung in der Produktion rekombinanter Proteine zu untersuchen.Weiters wurden als Abschluss die Produktionsbedingungen untersucht. Zum Beispiel wirkte sich eine Kultivierung bei niederen Temperaturen positiv auf die HRP Expression aus. Durch die Zugabe von Hemin wurde die Produktion von aktivem Enzym verbessert, da das sekretierte Apo-Enzym mit dem essentiellen Co-Faktor Häm gesättigt ist.

Zusammenfassung (Englisch)

The methylotrophic yeast Pichia pastoris (Komagataella phaffii) is a commonly used host for heterologous protein expression due to several advantages. For instance it is easy to manipulate genetically and can do typical eukaryotic post-translational modifications. P. pastoris facilitates protein secretion while small quantities of endogenous proteins are secreted into the media which simplifies the downstream processing.Using P. pastoris secretory pathway is known to be a bottleneck in producing secretory proteins and therefore limiting target protein titers. There are different approaches to enhance the secretory performance. First of all, secretory proteins need a signal sequence to target translocation into the ER. One of the most commonly used signal sequence is the prepro peptide of S. cerevisiae -mating factor (MF). There are many signal sequences available which can be used to substitute the MF prepro sequence which can be better suited to secret the protein of interest. As demonstrated in this thesis secretory HRP production the P. pastoris native acid phosphatase pre sequence in combination with a S. cerevisiae MF deletion mutant pro sequence reached the best activity for HRP so far.In addition helper proteins including chaperons involved in the unfolded protein response (UPR) or ER-associated degradation (ERAD) and the transcription factor Hac1 were overexpressed in order to evaluate their potential to aid the process of recombinant protein production. At the end also the refinement of production conditions was explored. For example cultivating at lower temperatures was found to favour functional HRP expression. Furthermore the addition of hemin was found to increase active enzyme production by efficiently saturating all secreted apo enzyme with the essential cofactor heme.