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Title
Isolation von Kardiomyozyten aus Herzen von adulten Wild-Typ und Adipöse Triglycerid-Lipase-Knockout Mäusen / vorgelegt von Nina Raidl
Additional Titles
Isolation of cardiomyocytes from hearts of adult wild-type and adipose triglyceride lipase knockout mice
AuthorRaidl, Nina
CensorSchrammel-Gorren, Astrid
PublishedGraz, 2016
DescriptionII, 46 Blätter : Illustrationen, Diagramme
Institutional NoteKarl-Franzens-Universität Graz, Diplomarbeit, 2016
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung des Verfassers/der Verfasserin
LanguageGerman
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (GND)Maus / Herzmuskelzelle / Isolierung <Mikrobiologie>
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-108204 Persistent Identifier (URN)
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Isolation von Kardiomyozyten aus Herzen von adulten Wild-Typ und Adipöse Triglycerid-Lipase-Knockout Mäusen [1.9 mb]
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Abstract (German)

Hauptziel meiner Diplomarbeit war es, eine Methode zur Isolierung von Herzmuskelzellen aus Herzen von adulten Wildtyp (WT) und Adipöse Triglycerid-Lipas Knockout (ATGL(-/-))-Mäusen zu etablieren. Bei der Isolierung von WT Kardiomyozyten konnte eine hohe Ausbeute an intakten Zellen erreicht werden, wobei die Faktoren Zeit, Enzymkonzentration sowie Arbeitsweise von Bedeutung waren. Die optimale Dauer des enzymatischen Verdaus betrug 7 min, die maximal effektive Konzentration der Liberase TH, welche aus Kollagenase I, Kollagenase II und der neutralen Protease Thermolysin besteht war 250 U/ml. Da sich Kardiomyozyten empfindlich gegenüber mechanischen Einflüssen erwiesen, wurde die Dissoziation des Gewebes durch vorsichtiges, wiederholtes Auf- und Abpipettieren der Zellsuspension vorgenommen. Die Kultivierung der Zellen erfolgte auf mit Laminin-beschichteten Schalen (1,5 g/cm) in einem mit Butanedione Monoxime und fetalem Kälberserum enthaltenem Medium (M-199). Die Isolierung der Kardiomyozyten aus Herzen von ATGL(-/-)-Mäusen führte mit dieser Präparationsmethode zu intakten Zellen in sehr geringer Ausbeute. Dies scheint auf die stark veränderte Zellstruktur der Lipid-beladenen Herzmuskelzellen dieser Mäuse zurückzuführen sein. Isolierten Herzmuskelzellen aus WT-Tieren wurden in Kultur mit Angiotensin II und Phenylephrin für 24 h behandelt und potenzielle Effekte der Agonisten auf Parameter von oxidativen Stress und Hypertrophie untersucht. Western Blot und quantitative PCR Analysen zeigten keine signifikanten Veränderungen in Angiotensin II- und Phenylephrin-behandelten Zellen. Durch Vergleich von isolierten WT- und ATGL(-/-)-Herzmuskelzellen mit den entsprechenden Totalhomogenaten konnte zwischen Kardiomyozyten-spezifischen und den in Leukozyten lokalisierten inflammatorischen Effekten in ATGL(-/-)-Herzen unterschieden werden. Isolierte Herzmuskelzellen stellen somit ein wichtiges Modell zur Untersuchung der Signaltransduktion in Kardiomyozyten dar.

Abstract (English)

The aim of this diploma thesis was to establish a method for the preparation and cultivation of adult cardiomyocytes from wild-type (WT) and adipose triglyceride lipase-deficient (AKO(-/-)) mice using Langendorff perfusion of isolated hearts. Optimization of the preparation method resulted in isolation of a largely intact rod-shaped population of WT cardiomyocytes. Experiments revealed an optimal digestion time of 7 min and a maximally effective liberase concentration of 250 U/ml. Since cardiomyocytes proved highly sensitive against mechanical stress, dissociation of digested tissue was performed carefully by repeated and slow pipetting of the suspension. Cells were cultivated on culture dishes coated with laminin (1,5 g/cm) in M-199 medium supplemented with butanedione monoxime und fetal calf serum. Using this method for isolation of cardiomyocytes from AKO(-/-) hearts resulted in a very low yield of intact cells which might be due to the different cell structure and or composition of lipid-enriched cardiomyocytes. Isolated WT cardiomyocytes were treated with angiotensin II and phenylephrin for 24 h. Potential hypertrophic and prooxidative effects of these agonists were measured by Western blot analysis and quantitative PCR. No significant effects of angiotensin II and phenylephrin were observed compared to untreated controls. Moreover, isolated WT and AKO(-/-) cardiomyocytes were compared to the respective cardiac (total) homogenates. With this approach we could distinguish between cardiomyocyte-located and leukocyte-specific inflammatory events present in AKO(-/-) hearts. In summary, isolation of cardiomyocytes represents a valuable tool to investigate intrinsic pathways of these cells.

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