Titelaufnahme

Titel
Enzyme engineering of nicotinamide binding in oxidoreductases
Verfasser/ VerfasserinBaumschlager, Armin
Begutachter / BegutachterinGlieder, Anton
Erschienen2015
Umfang137 Bl. : Zsfassungen (2 Bl.) ; Ill., graph. Darst.
HochschulschriftGraz, Univ., Masterarb., 2015
Anmerkung
Zsfussungen in dt. und engl. Sprache
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Nitratreduktase <NAD(P)H> / Nitratreduktase <NAD(P)H> / Online-Ressource
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-98040 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
Dateien
Enzyme engineering of nicotinamide binding in oxidoreductases [13.86 mb]
Links
Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

In dieser Arbeit wird eine Strategie zur Verbesserung der katalytischen Eigenschaften von NAD(P)H-abhängigen Enzymen vorgestellt. Diese Strategie umfasst die Identifizierung spezifischer Aminosäuren in der Kofaktorbindestelle von Oxidoreduktasen, basierend auf Strukturdaten des Proteins, anschließender Sättigungsmutagenese dieser Aminosäuren, und einer Selektion für erhöhte Enzymaktivität, und einer anschließenden biochemischen Charakterisierung von der in ihrer Aktivität verbesserten Enzymvarianten. Für die Sättigungsmutagenese wurden Aminosäuren gewählt, die sich innerhalb von 5 Å des N6 Atoms des Adenin des Kofaktors befinden und nicht über ihre Interaktion mit dem am C2-Phosphat der adeningebundenen Ribose an der Kofaktor-Abhängigkeit des Enzyms beitragen. Mit dieser Strategie konnte die katalytische Effizienz von fünf aus sieben wildtyp Enzymen (verschiedene KARIs, AtGR1, DmADH, CtXR, EcFucO), sowie drei in ihrer Kofaktorabhängigkeit geänderten Enzymen (Ec_IlvC6E6, Ec_IlvC2H10, AtGR1-LKD) gesteigert werden. Die verbesserten Varianten dieser Enzyme weisen Änderungen der Umsatzzahl (kcat), der Koenzym- und Substratbindung (KM), sowie der katalytischen Effizienzen (kcat/KM) auf. Daher könnte sich diese Strategie als äußerst nützlich zur Feinjustierung enzymatischer Eigenschaften für unterschiedliche Anwendungen erweisen, wie beispielsweise einen niedrigen Substrat-KM für Entgiftungsreaktionen, Anpassungen des Kofaktor-KMs beim Metabolic Engineering, Aktivitätswiederherstellung von gentechnisch veränderten Enzymen (z.B. nach Änderung der Kofaktorabhängigkeit), sowie hohe Umsatzzahlen für industrielle Konversionen.

Zusammenfassung (Englisch)

This work describes a strategy for improving catalytic properties of NAD(P)H- dependent oxidoreductases. The strategy comprises the identification of specific amino acid residues in the cofactor binding site of enzymes based on their tertiary structure, site-saturation mutagenesis of those residues, and screening for enzyme variants with improved properties, following biochemical characterization of improved variants. The amino acid residues in NAD(P)H-dependent enzymes chosen for site-saturation mutagenesis were located within 5 Å of the atom N6 of the rim of the cofactors adenine moiety and were presumably not involved in determination of the cofactor-preference through interaction of the phosphate in C2-position with the adenine-linked ribose. This strategy led to increased catalytic efficiencies on the substrates tested in five out of seven wild-type enzymes (KARIs, AtGR1, DmADH, CtXR, and EcFucO) as well as improvements of catalytic efficiencies of three enzymes with engineered cofactor preference (Ec_IlvC6E6, Ec_IlvC2H10, and AtGR1-LKD). Catalytic properties that were changed involve improved turnover numbers (kcat), cofactor and substrate binding (KM), and catalytic efficiencies (kcat/KM). Therefore, this approach could be used for fine- tuning of enzymatic properties for diverse applications from low substrate KM values for detoxification, adjustable cofactor KM for metabolic engineering, or activity regeneration of enzymes with engineered cofactor preference to high turnover numbers for industrial conversions.

Statistik
Das PDF-Dokument wurde 42 mal heruntergeladen.