Titelaufnahme

Titel
Qualitative and quantitative analysis of 13C-labeling dynamics in glucose and xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae / Lisa Werzer, BSc
Verfasser/ VerfasserinWerzer, Lisa
Begutachter / BegutachterinKlimacek, Mario
ErschienenGraz, March 2016
UmfangVI, 74 Blätter : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2016
Anmerkung
"13" im Titel hochgestellt
Zusammenfassungen in Deutsch und Englisch
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Primärstoffwechsel / Saccharomyces cerevisiae
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-97339 Persistent Identifier (URN)
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Qualitative and quantitative analysis of 13C-labeling dynamics in glucose and xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae [9.79 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Analyse zellulärer metabolischer Flüsse ist für das Verständnis des Phänotyps und der Physiologie einer Zelle von großer Bedeutung. Eine äußerst effiziente Methode zur unabhängigen Bestimmung intrazellulärer Flüsse und zur Analyse einzelner metabolischer Hotspots ist die sogenannte isotopisch instationäre metabolische Flussanalyse (INST-MFA). Aufbauend auf den Grundlagen der INST-MFA wurden mithilfe einer Filterkultivierungsmethode Unterschiede im Phänotyp von IBB10B05, einem rekombinanten evolvierten Saccharomyces cerevisiae Stamm, und seinem Vorläufer CEN.PK113-7D durch die Dynamik der 13C-Markierung intrazellulärer Metabolite sowohl qualitativ als auch quantitativ auf molekularer Ebene analysiert. Die untersuchten Stämme unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit auf Xylose zu wachsen, die spezifische Wachstumsrate von IBB10B05 ist im Zuge dieser Anpassung jedoch um 30% gesunken. Die Gründe hierfür sind nicht bekannt.Im Zuge dieser Arbeit wurde ein Workflow zur qualitativen und quantitativen Analyse dynamischer 13C-Markierung in S. cerevisiae entwickelt. Unter der Verwendung einer internen Standardisierung mittels 13C markierter Metabolitextrakte aus Hefe konnten 38 Metabolite aus verschiedenen Teilen des Hefemetabolismus quantifiziert und sowohl die metabolischen Umsetzungsraten als auch die dazugehörigen metabolischen Flüsse bestimmt werden. Die Resultate der 13C-Markierungsexperimente gaben aufschlussreiche sowie neue Einblicke in den zeitlichen und topologischen Aufbau der Stoffwechselwege im zentralen Kohlenstoffmetabolismus sowie in die Biosynthese von Cofaktoren, Adenylat und Aminosäuren frei. Außerdem konnten metabolische Hotspots identifiziert werden, welche zu Unterschieden im Phänotyp der beiden Stämme beitragen. Allerdings hat sich gezeigt, dass jene Konzentrationen an Xylose, die für das Wachstum von IBB10B05 nötig sind, nicht mit der folgenden LC/MS-Analyse kompatibel sind, weshalb diese Methode nicht für IBB10B05 kultiviert auf Xylose geeignet ist.

Zusammenfassung (Englisch)

Isotopically non-stationary metabolic flux analysis (INST-MFA) is a powerful tool with which intracellular metabolic fluxes of cells can be locally addressed thereby permitting analysis of metabolic hotspots independently. With the aim to analyze phenotypic differences of IBB10B05, a recombinant xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae, and its predecessor S. cerevisiae CEN.PK113-7D at molecular level principles of INST-MFA were applied in combination with a filter cultivation technique to study the dynamics in 13C-labeling of intracellular metabolites qualitatively and quantitatively. Strains investigated differed in their ability to grow on xylose. Furthermore in the course of evolutionary adaption of IBB10B05 to grow on xylose its specific growth rate on glucose was decreased by 30%. Underlying causes were not known.In this work a working routine for the qualitative and quantitative analysis of 13C-labeling dynamics in S. cerevisiae was developed. Internal standardization based on 13C-labeled yeast metabolite extract was found to be suitable for quantification of intracellular metabolites of filter grown cells. By applying this routine 38 metabolites of different parts in the metabolism could be quantified and their metabolic turnover rates of depletion of unlabeled metabolites as well as corresponding metabolic fluxes determined. Results obtained from 13C-labeling experiments using glucose as the sole carbon source revealed interesting and new insights into the temporal and topological organization of pathways in the central carbon metabolism as well as in cofactor, adenylate and amino acids biosynthesis. Metabolic hotspots could be identified that may contribute to phenotypic differences observed between the analyzed strains. However, INST-MFA based on filter cultivation was not applicable for IBB10B05 growing aerobically on xylose because xylose concentrations required for growth of IBB10B05 were in a range not compatible with subsequent analysis by LC/MS.

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