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Title
Production and characterization of a hypoallergenic variant of the Major Peanut Allergen Ara h 2 in Pichia pastoris / vorgelegt von Barbara Jadwiga Staudigl
AuthorStaudigl, Barbara Jadwiga
CensorOrtner, Astrid
PublishedGraz, Februar 2016
Description88 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Institutional NoteKarl-Franzens-Universität Graz, Diplomarbeit, 2016
Annotation
Zusammenfassungen in Deutsch und Englisch
LanguageEnglish
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (GND)Erdnuss / Allergen / Pichia pastoris / Genexpression
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-96509 Persistent Identifier (URN)
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Production and characterization of a hypoallergenic variant of the Major Peanut Allergen Ara h 2 in Pichia pastoris [11.42 mb]
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Abstract (German)

Gegen Erdnussallergie, bei Kindern eine häufige und meist lebenslange Krankheit,ist wegen des hohen Risikos von Nebenwirkungen keine spezifische Immuntherapiezugelassen. Einem derzeitigen Trend folgend, war das Ziel dieser Arbeit dierekombinante Herstellung eines modifizierten Erdnusshauptallergens (Ara h 2) mitfolgenden Eigenschaften: verringerter IgE Bindungskapazität, konservierten T-ZellEpitopen und Erhaltung der Tertiärstruktur des Proteins. Durch rationales Designwurde ein modifiziertes Ara h 2 (rAra h 2 mut) ohne die unstrukturierten terminalenProteinregionen und den großen hypervariablen Loop mit den meisten IgEBindungsepitopen hergestellt. Die Gene für rAra h 2 wt und rAra h 2 mut wurdenKodon-optimiert für die Expression in P. pastoris synthetisiert und in den pPICZ?-AVektor kloniert; dabei wurde die Gene in den Leserahmen der ?-Faktor Sequenz fürextrazelluläre Expression eingefügt. Die Konstrukte wurden in P. pastoris GS115transformiert und die rekombinanten Allergene wurden nach dreitägiger Expressionin MGYH/MMH Medium mit 1% Methanol bei 24C mittels Heparin-Affinitätschromatographiegereinigt; die Ausbeute an extrazellulärem rAra h 2 mut betrug 28mg/l. Die Identität des gereinigten rAra h 2 Allergens mut wurde durch N-terminaleSequenzierung sowie durch MALDI-TOF Analyse seiner Molekülmasse bestätigt.Das ferne UV-Spektrum von rAra h 2 mut mit 2 Minima bei 209 nm und 220 nmentsprach jenem des natürlichen Proteins. Die IgE-Bindungskapazität desHypoallergens im Vergleich zu nAra h 2 wurde mittels IgE-ELISA und IgE-InhibitionsELISA ermittelt. Die IgE-Bindungskapazität von rAra h 2 mut war dabei in 90% dergetesteten Seren um mehr als 50% reduziert. Zusammenfassend konnte ein korrektgefaltetes Hypoallergen von rAra h 2 hergestellt werden, welches, nach Maßgabeweiterer Tests, ein potenzieller Kandidat für eine sichere und effektiveImmuntherapie sein könnte.

Abstract (English)

Peanut allergy is common in children and rarely outgrown. For this allergy, nospecific immunotherapy is available due to the high risk of adverse side reactions. Acurrent approach focuses on modified allergens with reduced IgE binding capacitybut preserved T cell epitopes. The aim of this work was the recombinant productionof a modified major peanut allergen, Ara h 2, exhibiting reduced IgE binding capacityand preserved T cell epitopes while retaining its intact tertiary structure. A modifiedAra h 2 without unstructured regions at the termini and the large hypervariable loopcontaining most of the IgE binding epitopes was engineered (rAra h 2 mut). Thesynthetic genes for rAra h 2 wt and rAra h 2 mut were codon-optimized forexpression in P. pastoris and cloned into the pPICZ?-A vector, in frame with the ?-factor sequence for extracellular expression. Following transformation of theconstruct into P. pastoris GS115 and optimization of expression conditions, rAra h 2mut was purified using a Heparin affinity column. A 3-day culture grown at 24C inMGYH/MMH media containing 1% methanol yielded 28 mg/l of extracellularlyexpressed rAra h 2 mut. The identity of purified rAra h 2 mut was confirmed by Nterminalsequencing and determination of its molecular mass by which correspondedto the calculated mass. The far-UV spectrum of rAra h 2 mut showed 2 minima at209 nm and 220 nm corresponding to those of the nature protein. The IgE-bindingcapacity of the hypoallergen in comparison to nAra h 2 was evaluated by IgE-ELISAand IgE-ELISA inhibition assays. The IgE binding capacity of rAra h 2 mut wasreduced by more than 50% in 90% of tested sera from peanut allergic patients. Thispoints to the conclusion that a correctly folded, recombinant hypoallergenic Ara h 2was successfully produced. These results suggest rAra h 2 mut is a potentially safeand effective immunotherapeutic agent for peanut allergy, even if further tests arenecessary.

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