Titelaufnahme

Titel
Establishment of a mass spectrometry-based high-throughput sample work-up protocol and intracellular metabolite profiling of Glioblastoma multiforme cells / Elmar Erwin Zünger, BSc
Verfasser/ VerfasserinZügner, Elmar
Begutachter / BegutachterinKlimacek, Mario
ErschienenGraz, January 2016
UmfangVII, 97 Seiten : 1 CD-ROM ; Diagramme
HochschulschriftKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2016
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung des Verfassers/der Verfasserin
SpracheEnglisch
DokumenttypMasterarbeit
Schlagwörter (GND)Metabolit / Krebszelle
URNurn:nbn:at:at-ubg:1-96406 Persistent Identifier (URN)
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Establishment of a mass spectrometry-based high-throughput sample work-up protocol and intracellular metabolite profiling of Glioblastoma multiforme cells [4.06 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Metabolite sind als biologische Zwischenprodukte biochemischer Reaktionen essentiell für die lebende Zelle, da sie aktive Stoffwechselwege verbinden. Metabolit- Levels geben einen einzigartigen chemischen Fingerabdruck des physiologischen Zustands der Zelle und erlaubt die Definition des zellulären Phänotyps durch das Messen der Metabolit- Profile. Adhärente Zellen sind weit verbreitet in klinischen Bereichen, wodurch diese Zellsysteme relevante Ziele für Metabolomics-Studien darstellen. Die hohe Analytzahl erfordert ein maßgeschneidertes Quenching- und Extraktionsprotokoll, sowie eine hochentwickelte Detektions- und Datenauswertungsmethode. Vor allem klinische Anwendungen benötigen High-Throughput Methoden. Da bekannte Probenaufarbeitungsprotokolle und Datenauswertungsmethoden nicht ausreichten, musste ein geeignetes Protokoll entwickelt werden. Um den Krebszellstoffwechsel zu untersuchen, wurde eine Bibliothek mit Informationen über LC-MS spezifischen Daten von 207 Metaboliten erstellt. Ein neuartiges Probenaufarbeitungsprotokoll, basierend auf „Boiling Ethanol“, wurde für adhärent wachsende Säugetierzellen entwickelt, wobei der Glioblastoma multiforme Stamm U-87 MG (GBM) als Repräsentant gewählt wurde. Gegenüber der derzeit etabliertesten Methode zeigte dieses Protokoll höhere Metabolitausbeuten und erlaubte eine 7-fach schnellere Probenprozessierung. Die Ausbeute konnte durch ein zusätzliches „Post Treatment“ weiter erhöht werden. Umfassende Temperatur- Profiling- Studien zeigten, dass der „Workflow“ signifikant die Probentemperatur beeinflusste. Weiters wurde ein Software- Tool identifiziert, das eine bis zu 40 Stunden schnellere Datenanalyse ermöglicht. Die Tauglichkeit des neuen Aufarbeitungsprotokolls wurde in dieser Arbeit demonstriert und angewandt. Metabolit- Profiling von GBM Zellen, kultiviert unter zwei physiologischen Zuständen, führte zu Zielen von potentieller klinischer Relevanz und repräsentieren ein Fundament für nachfolgende Studien.

Zusammenfassung (Englisch)

As a result of their role as biological intermediates of biochemical reactions, metabolites play an important part for the living cell connecting the many different active pathways. The metabolite levels give a unique chemical fingerprint for a physiological cellular state, making it possible to define the cell phenotype by measuring the metabolite profile. Adherently growing cells are widely used in clinical applications, making these cell systems relevant targets for metabolomics studies. Due to the large number of analytes, a tailored quenching and extraction protocol, as well as a highly sophisticated metabolite detection and data assessment method is a necessity. Especially in clinical applications the need for a high-throughput method has emerged. Because known sample work-up protocols and data assessment methods were insufficient, a suitable protocol had to be developed.To study cancer cell metabolism comprehensively a library containing information about LC-MS specific data of 207 metabolites was compiled. A novel sample work-up protocol based on boiling ethanol for adherently growing mammalian cells using Glioblastoma multiforme strain U-87 MG (GBM) as a representative was developed. Compared to the currently most established method the new protocol displayed higher metabolite coverage and samples could be 7-times faster prepared. This coverage could be further expanded when including the additional Post Treatment. Comprehensive temperature profiling studies revealed that the workflow had significant influence on the sample temperature. Furthermore a suitable software tool was identified that allows an up to 40 hours faster data analysis. The suitability of the novel sample work-up protocol was demonstrated and applied. Metabolite profiling of GBM cells grown at two different physiological states led to targets of potential clinical relevance and represent a fundament for subsequent studies.